肟类化合物水解碘化乙酰硫代胆碱及对乙酰胆碱酯酶恢复作用研究

摘要

本文系统研究了：1)三种肟类化合物(氯解磷定(Pralidoxime Chloride，2-PAM-C1)，双磷定(Trimedoxime，TMB<,4>)和双复磷(Obidoxime Chloride，LH<,6>))的非经典功能一水解乙酰胆碱(碘化乙酰硫代胆碱(acetylthiocholine iodide，ATCh)和碘化乙酰胆碱(acetvlcholine iodide))；2)三种肟类化合物(2-PAM-C1，TMB<,4>和LH<,6>)的经典功能一对中毒乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的恢复作用；3)中毒AChE的恢复和老化性质。结果表明： 1.三种肟类化合物的非经典功能-水解乙酰胆碱能力比较 (1)三种肟类化合物均能明显的水解ATCh，并且水解能力随着温度，pH值和反应时间的升高而增强。以肟类化合物TMB<,4>水浴孵温30℃条件为例：随着pH值由7.0到8.0，反应2 h后的OD<,412>也分别0.90和2.08。同样当反应温度的升高水解能力增强。例如反应温度为5℃，15℃，30℃，37℃和40℃，反应2 h后的OD<,412>也分别为0.028，0.29，0.99，0.94和1.067。 (2)当pH≤6.2时，三种肟类化合物对ATCh仅有微弱水解，并且随着温度和pH值的增加水解的增幅也较小。水解能力较强的TMB<,4>在水浴孵温37℃反应4h时的OD<,412>也仅为0.29，LH<,6>的仅为0.20；相反当pH≥7.0时，三种肟类化合物对ATCh水解明显，并且随着温度和pH值的增加水解的增幅也较大。 (3)三种肟类化合物对ATCh的水解能力随着肟类化合物终浓度的升高而增强。如pH为7.0，ATCh终浓度为0.6 mmol/L，反应温度为30℃， 当2-PAM-CI终浓度依次为0.001，0.01，0.05，0.1，0.2和0-5 mmol/L时，反应20 min后的OD412分别0.0013，0.0057，0.0387，0.1037，0.2313和0.6083。 (4)三种肟类化合物对ATCh的水解能力随着ATCh浓度的升高而增强。如pH为7.0，2-PAM-C1终浓度为0.05mmol/L，反应温度为30℃，当ATCh终浓度依次为0.006，0.06，0.12和0.6 mmol/L时，反应20 min后的OD<,412>也分别0.00，0.0023，0.0100和0.0670。 (5)以上的实验均采用微量DTNB显色法测定三种肟类化合物对ATCh的水解能力，实验结果均显示在相同条件下TMB<,4>和LH<,6>的水解能力比2-PAM-Cl强。如2-PAM-C1，TMB<,4>和LH<,6>在pH为7.0，温度30℃反应4 h后的OD<,412>分别为0.2715，1.4487和1.436。 (6)利用Michel法比较研究了三种肟类化合物在pH为8.0的巴比妥钠一KH<,2>PO<,4>-NaCl缓冲液中对碘化乙酰硫代胆碱(acetylthiocholine iodide，ATCh)和碘化乙酰胆碱(acetylcholine iodide)的水解能力。结果显示：三种肟类化合物均能够水解ATCh，但均不能水解碘化乙酰胆碱；在相同条件下2-PAM-C1的水解能力比TMB<,4>和LOH<,6>强。在水浴孵温25℃ 2-PAM-C1、TMB<,4>和LH<,6>与ATCh反应1h后缓冲液pH值降低量依次为0.8625，0.582和0.678；但是3种肟类化合物与碘化乙酰胆碱反应后的pH值降低量依次为0.0158、0.0584和0.0299，实际接近0。 2．辛硫磷对几种生物AChE的抑制中浓度(I<,50>)的测定 辛硫磷对番鸭脑AChE的I<,50>最高为9×10<'-4>，其次为对家兔脑AChE的2.4×10<'-4>，对小菜蛾AChE和鲫鱼脑AChE的1<,50>均为1.8×10<'-4>，对菜蛾绒茧蜂AChE的I<,50>与对蟑螂头部AChE的基本一致，分别为4.0×10<'-5>和4.2×10<'-5>，对家蝇头部AChE的I<,50>最低，仅为6×10<'-6>。 3．以I<,50>剂量的辛硫磷抑制几种生物AChE分别测定其老化常数 用肟类化合物TMB<,4>分别测得I<,50>剂量的辛硫磷抑制的小菜蛾AChE、蟑螂头部AChE和家兔脑AChE的老化常数分别为0.0129，0.0111和0.0173；老化时间t<,0.5>分别为53.7 h，62.4 h和40.06 h；t<,0.99>分别为357 h，414.9 h和266.2 h。用肟类化合物LH<,6>分别测得I<,50>剂量的辛硫磷抑制的菜蛾绒茧蜂AChE和鲫鱼脑AChE老化常数依次为0.0143和0.0105；老化时间t<,0.5>分别为48.5 h和66 h；t<,0.99>分别为322.0 h和438.6 h。 4．三种肟类化合物对中毒AChE恢复能力比较 从3种肟类活化剂对鲫鱼脑AChE和家兔脑AChE重活化能力比较来看：LUH6和TMB4的重活化能力明显比2-PAM-C1强，但LH<,6>、TMB<,4>和2-PAM-C1对小菜蛾等昆虫被辛硫磷抑制的AChE重活化能力比较并没有呈现较强规律性。

目录

声明

摘要

1.前言

1.1 AChE的研究现状

1.1.1 AChE的分布

1.1.2AChE结构与功能的研究进展

1.1.3 AChE的分子类型及基因结构

1.1.4 AChE与抗药性的研究现状

1.2肟类化合物对中毒AChE重活化作用的研究现状

1.2.1肟类化合物的分类

1.2.2肟类化合物对中毒AChE重活化作用的研究现状

1.2.3肟类的化合物的“非重活化效应”

1.3 AChE老化机制研究进展

1.4本实验的研究意义

2实验材料与方法

2.1供试药剂与材料

2.2反应体系缓冲液的配制

2.2.1反应体系缓冲液PBS的配制

2.2.2巴比妥钠-KH2PO4-NaCl缓冲液的配制

2.3实验方法

2.3.1 3种肟类化合物对乙酰胆碱(acetylthiocholine-iodide和acetylcholine-iodide)的水解作用

2.3.2 AChE的制备

2.3.3 AChE活性的测定

2.3.4辛硫磷对AChE的毒力I50的测定

2.3.5 3种肟类化合物对中毒AChE重活化的测定

2.3.6辛硫磷中毒AChE老化的测定

3结果与分析

3.1 3种肟类化合物对乙酰胆碱的水解作用

3.1.13种肟类化合物随反应温度、反应时间和pH变化对ATCh水解作用

3.1.2 3种肟类化合物对ATCh水解作用(后加DTNB)

3.1.3不同终浓度的3种肟类化合物对相同终浓度ATCh的水解作用(后加DTNB)

3.1.4相同终浓度3种肟类化合物对不同终浓度ATCh水解作用

3.1.5 Michel法测定3种肟类化合物对乙酰胆碱的水解作用

3.2辛硫磷(Phoxim)对AChE的毒力(I50)的测定

3.3 3种肟类化合物对中毒AChE重活化的测定

3.4中毒AChE老化的测定

4结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

参考文献

致 谢