点带石斑鱼病毒性神经坏死病研究

摘要

病毒性神经坏死病(Viral nervous necrosis disease，VNN disease)为近年来我国沿海石斑鱼养殖厂上极为严重的疾病，其致病原为神经坏死病毒(NervousNecrosis Virus)，此病毒感染易造成石斑鱼及幼鱼的大量死亡，死亡率往往高达90％，造成我国石斑鱼养殖业极大的损失。该病毒为两条单股RNA，分别为RNA1和RNA2，其中RNA1的功能为RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)，RNA2则可以转录翻译出病毒的外壳蛋白。 本研究中，应用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RRT-PCR)等实验方法，对近年来福建南部地区海水养殖点带石斑鱼暴发性的传染病进行调查和研究。阐明了该地区养殖石斑鱼传染病的主要种类及其流行病学特征。病毒性神经坏死病是该地区最常见、危害也最大的传染病。该传染病具有典型的神经症状，游动异常，中枢神经和视网膜组织出现空泡坏死病变。病鱼除了神经异常外，无其它临床症状，体表及体内也无明显的病理变化或寄生虫寄生。该病可通过鱼卵垂直传播，也可经养殖水体水平传播。来自受感染亲鱼的垂直传播是鱼苗感染的主要途径。各种石斑鱼以及生长阶段的石斑鱼均易感，但对幼体的危害更严重。 本试验建立了逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测点带石斑鱼神经坏死病毒(NNV)的检测方法，并应用到传染病调查和厦门1:2岸进出境鱼类病害检疫中。同时，用组织切片法对石斑鱼脑部和视网膜的特征性病变进行观察验证，也说明该检测方法具有良好的特异性和敏感性，能够检测到Pg级的核酸量。证明该方法是一种快速、简便、准确的检测方法。应用该方法对厦门地区海域十几种海洋鱼类进行检测，发现了有些兰子鱼，黄鳍鲷呈阳性。说明厦门海区神经坏死病毒主要感染石斑鱼类及少量其它鱼类。 采用TaqMan探针技术，并且将假病毒技术构建的含有神经坏死病毒RNA2基因组的MS2噬菌体假病毒作为阳性质控品，建立了TaqMan探针检测点带石斑鱼神经坏死病毒的荧光定量PCR方法，对影响PCR反应的Mg<'2+>浓度和退火温度等条件进行了优化，并建立了标准曲线，能够在检测中病毒检测中进行绝对定量，最低能检测10个病毒，在实际检测运用中取得很好的效果。 本文还首次测定了点带石斑鱼神经坏死病毒(MCNNV)RNA1和RNA2基因组的全序列。RNA1由3103个核苷酸组成，含有一个编码982个氧基酸的开放阅读框，分子量为110.40 kD．；RNA2由1433个核苷酸组成，含有一个编码338个氨基酸的开放阅读框，分子量为37.06 kD。对DGNNV RNA1和RNA2序列以及推导的氨基酸序列与GenBank中的其它罗达病毒的基因序列进行了同源性比较。表明所有已知的石斑鱼神经坏死病毒的基因序列具有很高的同源性，与其它鱼类NNV的同源性也较高，与感染昆虫的罗达病毒的同源性则较低。系统进化分析也证明所有石斑鱼神经坏死病毒在进化上都处于同一水平。MGNNV属于RGNNV基因型的成员。

目录

论文说明：缩略词

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摘要

第一章综述

1.病毒性神经坏死病概况

2.鱼类神经坏死病毒的分子结构

3鱼类神经坏死病毒的危害

4神经坏死病毒的传播途径

5神经坏死病毒的检测方法

5.1显微镜观察法

5.2免疫学方法

5.3分子生物学方法

5.4细胞培养法

6病毒性神经坏死病的防治

7本研究的目的和意义

第二章神经坏死病毒的确认及组织病理学与电镜观察

1材料

1.1实验鱼

1.2引物

1.3试剂

2方法

2.1 NNV的RT-PCR检测

2.2组织病理学观察

3结果

3.1 NNV的RT-PCR检测结果

3.2组织病理学与电镜观察结果

4讨论

4.1病毒性神经坏死病毒的危害性

4.2石斑鱼神经坏死病的病理特征

4.3石斑鱼NNV的传播途径及其防治

5小结

第三章RT-PCR检测石斑鱼NNV方法的建立和应用

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2 PCR扩增结果的判定

2.1阳性结果确认

2.2 PCR反应条件的优化结果

3方法运用

4讨论与小结

4.1总RNA抽取注意事项

4.2 PCR产物的电泳检测

4.3试验中RT-PCR存在的问题及解决方法

4.4 RT-PCR技术检测神经坏死病毒的特异性和灵敏度

第四章荧光定量PCR法检测石斑鱼神经坏死病毒

1材料

1.1病鱼

1.2引物和探针

1.3阳性质控品

1.4仪器和试剂

2方法

2.1总RNA提取

2.2探针和引物的设计

2.3阳性质控品的制备

2.4实时荧光定量RT-PCR反应

2.5 RT-PCR反应体系和反应程序的优化

2.6实时荧光定量RT-PCR的特异性

2.7 MS2噬菌体阳性质控品的重复性与稳定性测试

2.8 MS2噬菌体阳性质控品线性范围的确定

2.9 MS2噬菌体阳性质控品标准曲线的建立

2.10临床病料的实时荧光定量RT-PCR检测

3结果

3.1实时荧光定量RT-PCR反应体系的优化

3.2实时荧光定量RT-PCR的特异性的测试

3.3 RRT-PCR与常规RT-PCR敏感度的比较

3.4 MS2噬菌体阳性质控品的重复性与稳定性测试

3.5 MS2噬菌体阳性质控品线性范围的确定

3.6 MS2噬菌体阳性质控品标准曲线的建立

3.7临床病料的实时荧光定量RT-PCR检测

4讨论

5小结

第五章点带石斑鱼神经坏死病毒RNA1和RNA2基因组序列测定和分析

1材料

1.1病鱼来源

1.2引物和试剂

1.3分析软件

2方法

2.1引物的设计与合成

2.2总RNA的抽提

2.3 cDNA合成

2.4 PCR扩增

2.5 PCR产物检测及纯化

2.6基因组序列测定和分析

3结果

3.1 RT-PCR结果

3.2点带石斑鱼NNV核苷酸序列检测结果

4点带石斑鱼NNV核苷酸序列分析

4.1核苷酸同源性比较

4.2氨基酸序列比较

4.3系统发育进化分析

5讨论

6小结

参考文献

致谢