转ScMV-CP基因甘蔗抗病的分子基础及环境安全性评价

摘要

甘蔗花叶病严重影响甘蔗生长，是甘蔗生产中主要病害之一。通过基因工程培育抗花叶病品种是甘蔗高效育种的辅助手段，2003年农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室通过基因枪介导将ScMV-CP基因转入高感花叶病的甘蔗品种拔地拉(Badila)，获得了13个转ScMV-CP基因甘蔗无性系。本研究以转CP基因甘蔗作为材料，研究转基因甘蔗的抗病稳定性和工农艺性状表现；通过转基因甘蔗的光合特性研究其增产的光合基础；通过反复抗性鉴定，从中选择抗病强转基因无性系进行人工接种研究其抗病的生理生化基础和分子基础；并对转基因甘蔗环境安全性进行了初步评价；研究结果表明： 转基因甘蔗明显提高了抗甘蔗花叶病毒的能力，人工接种和自然诱发鉴定，花叶病发病率在0-34％之间，而且在不同世代保持稳定的水平；而非转基因甘蔗拔地拉(Badila)发病率达92-100％；通过工农艺性状和抗病性综合考察，选出了5个转基因甘蔗进入环境释放，结果表明：转基因甘蔗发病率在0-20％之间，株高比非转基因甘蔗增加23-32％，有效茎数增加45-55％，每公顷蔗茎产量增加62-80.6％，甘蔗糖分绝对值提高1.15-2.15％。在13个转CP基因甘蔗中以转基因甘蔗B48表现最为优异，在多年的人工抗性鉴定和自然诱发鉴定均未发病，综合农艺性状表现优异。 通过转基因甘蔗B48与非转基因甘蔗叶片细胞超微结构、叶绿体蛋白质组及叶片光合特性的比较，结果表明：非转基因甘蔗的叶片细胞超微结构呈典型的甘蔗花叶病毒侵染后的病理特征；叶片中细胞叶绿体被破坏，基粒片层消失；通过叶绿体蛋白的双向电泳进一步发现，非基因甘蔗叶绿体光系统Ⅰ、光系统Ⅱ中光系统Ⅰ蛋白、放氧复合体(OEC)蛋白下调，说明病毒侵染对非转基因甘蔗叶绿体的光系统Ⅰ、光系统Ⅱ造成损伤，从而使非转基因甘蔗叶片的CO<,2>同化能力下降；而转基因甘蔗的叶片细胞保持完整，细胞内未发现病毒粒子，叶绿体结构清晰，光系统保持正常，叶绿素含量高，PEPC酶活性强，从而使转基因甘蔗保持较高光合作用能力。 接种甘蔗花叶病毒后，转基因甘蔗接种后游离．SA增加的量比原种大，时间提前，同时SOD、POD活性提高，CAT活性显著降低，这有利于增加体内H<,2>O<,2>的积累，加强了细胞壁的氧化交联，限制了病毒进一步侵染；而非转基因甘蔗SOD、POD活性提高缓慢，下降快，CAT活性下降慢，影响了H<,2>O<,2>的积累，无法及时有效地建立抗病信号的传导途径来诱导抗性基因的表达。苯丙烷代谢研究结果表明，转基因甘蔗在接种后叶片PAL活性迅速上升，并保持相对较高的水平；而转基因甘蔗PAL活性上升要滞后于转基因甘蔗，而且下降迅速。非转基因甘蔗PPO活性上升比转基因甘蔗慢而且增加的幅度也小；转基因甘蔗接种后积累类黄酮速度快，持续时间长，含量增幅较大，在整个过程中保持一个相对较高的浓度，非转基因接种后类黄酮含量下降而且变动幅度大。 利用本实验室开发的斑茅(甘蔗的近缘属植物)干旱胁迫下的cDNA微阵列，研究了转基因甘蔗B48和非转基因甘蔗接种后基因表达的差异情况，结果表明：转因甘蔗接种后上调表达的克隆有43个，主要参与细胞的结构保护、信号传导、蛋白质合成、能量代谢、呼吸作用等有关过程；这说明接种病毒激活了转基因甘蔗体内众多抗病基因。利用芯片杂交的结果，克隆了候选MYB基因的片段，生物信息学分析该MYB基因属于典型R2R3 MYB转录因子，实时定量PCR分析表明所克隆的甘蔗MYB基因在不同组织表达特异性不明显，但是受外源SA和H<,2>O<,2>强烈诱导。 接种后的叶片蛋白质组研究表明：转基因甘蔗与非转基因甘蔗的叶片蛋白的2-DE图谱有明显差异，在转基因甘蔗叶片中有10个蛋白表达上调，1个蛋白特异诱导表达；而非转基因甘蔗中3个表达上调，1个特异诱导。质谱鉴定表明，转基因甘蔗中核因子激酶、细胞质APX和Mn-SOD被诱导上调表达；而在非转基因甘蔗中铁氧还蛋白和甘蔗旱诱导蛋白表达上调。 转基因甘蔗环境安全性评价结果表明：田间转基因甘蔗与非转基因甘蔗害虫的危害没有差异，在土壤总DNA未检测到外源ScMV-CP基因；转基因甘蔗根际土壤的细菌和真菌数量明显提高，但放线菌数量差异不明显；转基因甘蔗中的NPTⅡ标记基因并没有增加对卡那霉素抗性的土壤微生物数量；转基因甘蔗和非转基因甘蔗根际细菌多样性研究表明，Simpson指数(D’)、Shannon-Wiener指数(H’)、Mclntosh指数(DMc)差异不明显，说明转基因甘蔗对土壤细菌的多样性影响很小；转基因甘蔗显著提高了根际土壤脲酶活性，但对土壤的蔗糖酶和磷酸单脂酶没有影响。初步研究表明，转基因甘蔗对土壤细菌和真菌有一定的影响，但对放线菌影响很小；就目前来看，短期内对土壤肥力没有不利影响。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1.甘蔗花叶病的发生危害与基因工程育种

1.1甘蔗花叶病的发生危害

1.2马铃薯Y病毒属侵染植物的细胞病理特征

1.3植物病毒侵染对光合作用的影响

1.4甘蔗抗花叶病毒基因工程育种

2.植物抗病的生理生化基础

2.1活性氧在植物抗病的作用

2.2苯丙烷代谢与植物抗病的关系

3.植物抗病的分子基础

3.1cDNA microarray在植物与病原互作研究中的应用

3.2差异蛋白质组学在植物与病原互作研究中的应用

4.转基因植物的安全性

4.1转基因作物的安全性问题

4.2转基因植物中外源基因的漂移

4.3转基因植物对生物多样性的影响

4.4转基因植物抗性丧失

4.5抗病毒转基因植物的风险

4.6转基因作物对土壤微生态环境的影响

4.7标记基因的安全性问题

4.8展望

5.本研究的目的、意义及主要研究内容

5.1目的及意义

5.2主要研究内容及技术路线

第二章转ScMV-CP基因甘蔗抗病稳定性及工农艺性状表现

1材料与方法

1.1供试材料

1.2方法

2结果与分析

2.1转基因甘蔗的抗病稳定性

2.2第三代转基因甘蔗的农艺性状表现

2.3第四代转基因甘蔗环境释放的工农艺性状表现

2.4转基因无性系的综合评价

3讨论

第三章转ScMV-CP基因甘蔗增产的光合基础

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

1.3数据整理与分析

2.结果与分析

2.1转ScMV-CP基因甘蔗和非转基因甘蔗叶片细胞超微结构比较

2.2转基因甘蔗与未转基因甘蔗叶绿体蛋白的差异表达

2.3转基因甘蔗与非转基因甘蔗叶片光合特性的比较

3.讨论

第四章转ScMV-CP基因甘蔗抗花叶病的的生理生化基础

1材料与方法

1.1材料

1.2接种方法

1.3测定方法

1.4数据分析

2结果与分析

2.1 SA与转基因甘蔗的抗病性关系分析

2.2转基因甘蔗接种后活性氧代谢的变化

2.3转基因甘蔗对PAL代谢的影响

3.讨论

第五章转ScMV-CP基因甘蔗抗花叶病的分子基础

1.材料与方法

1.1材料

1.2病毒接种及取样

1.3生化试剂

1.4 cDNA芯片杂交

1.5 cDNA克隆测序及序列分析

1.6甘蔗Myb基因编码区的分离克隆

1.7目的片段测序和分析

1.8实时PCR半定量法分析甘蔗MYB基因表达

1.9叶片全蛋白的双向电泳及质谱分析

2结果与分析

2.1 RNA的质量分析

2.2ScMV诱导表达的cDNA基因芯片分析

2.3甘蔗MYB基因的克隆与表达分析

2.4转基因甘蔗与未转基因甘蔗叶片全蛋白的差异表达

3.讨论

3.1转基因甘蔗抗病的分子基础

3.2Myb转录因子的片段克隆及表达分析

3.3转基因甘蔗抗病的蛋白基础

第六章转ScMV-CP基因甘蔗环境安全性评价

1材料与方法

1.1材料种植及土样采集

1.2方法

1.3数据分析

2结果与分析

2.1转基因甘蔗对田间非靶标害虫的影响

2.2转基因甘蔗外源CP基因的土壤水平转移

2.3转基因甘蔗对土壤可培养微生物数量的影响

2.4根际土壤卡那霉素抗性微生物数量的比较

2.5转基因甘蔗对根际土壤酶活性的影响

2.7转基因甘蔗对土壤pH值和土壤电导率的影响

2.7转基因甘蔗对土壤细菌多样性的影响

3.讨论

结论

1.转基因甘蔗抗病稳定性和增产基础

1.1转基因甘蔗抗病稳定性和农艺性表现

1.2转基因甘蔗增产的光合基础

2.转基因甘蔗抗病的分子生理基础

2.1转基因甘蔗抗病的生理生化基础

2.2转基因甘蔗抗病的基因分子基础

2.3转CP基因甘蔗抗病的可能分子生理机制初探

3.转CP基因甘蔗的环境安全性评价

4.展望

5.在学期间发表的论文

参考文献

附录

致谢