金龟子绿僵菌松墨天牛优良菌株筛选及其林间宿存研究

摘要

松墨天牛是重大森林植物检疫性病害-松材线虫病的主要媒介昆虫。本文主要内容是筛选防治松墨天牛的金龟子绿僵菌优良菌株，并研究金龟子绿僵菌在森林生态系统中的宿存动态，为利用天敌微生物防治松墨天牛提供菌株资源和理论依据。 从福建的40个县(市、区)、江西省井冈山和吉安2个市，共110个林分样区(其中松林88个样区)采集土壤样品330份，采用选择性培养基分离土壤金龟子绿僵菌，结果21个样区(其中松林16个)的26份土样中分离到金龟子绿僵菌，占采集样区数的19.1％和样品数的7.9％，土壤成菌落数(CFU)500-72500 CFU·g<'-1>，表明金龟子绿僵菌在森林土壤中有较为广泛的分布。 对国内外20株分离自不同寄主的金龟子绿僵菌菌株的产孢情况、孢子萌发率进行了研究。在此基础上，采用幼虫(3～4龄)浸渍法(1×10<'7>孢子·mL<'-1>)和成虫跗节接种法测定对松墨天牛的致病力。结果不同菌株间产孢量、孢子萌发率和致病力存在显著差异，MaYTTR-04、MaYTTR-03、MaZPTR-01、MaJGSTR-01、JPMa1291、JPMa1349、JPMa2049等7个菌株表现较为优良；尤其是MaYTTR-04、MaYTTR-03、JPMa2049等3个菌株的综合性状最好，产孢量分别为(2.18±0.12)×10<'8>、(1.25±0.05)×10<'8>、(8.92±0.16)×10<'7>孢子·cm<'-2>；对幼虫死亡的高峰期在15～18d，在接种后21d僵虫率分别为80.0％、76.0％和93.1％；3个菌株对成虫的死亡高峰期在12～15d，接种后21d校正死亡率分别达93.3％(1.2×10<'6>±2.0×10<'5>孢子/成虫)、86.7％(1.5×10<'6>±5.0×10<'5>孢子/成虫)和94.4％(3.4×10<'6>±3.24×10<'5>孢子/成虫)，僵虫率分别达83.4％、88.9％和75.0％，其中Ⅱ级僵虫(孢子覆盖虫体50％以上)分别为66.7％、55.6％和53.1％。 MaYTTR-04菌株在25±1℃恒温条件下，接种量为2.3×10<'6>±0.2×10<'6>孢子/成虫、2.3×10<'5>±0.2×10<'5>孢子/成虫的情况下时间效应指标值LT<,50>分别为14.7d和18.5d；而室温条件下(25℃～32℃)，这两个剂量相应的LT<,50>分别为12.9d和17.9d，表明该菌在较高的变温环境下仍具有较强致病力。林间套笼21d成虫平均死亡率为60％，僵虫率为48.9％。 将JPMa1349、JPMa2049金龟子绿僵菌孢子置于马尾松树干表皮不同方位；将JP1349、JP2049、MaZPTR-01菌株孢子与土粉混合后埋入马尾松纯林、马尾松与木荷混交林和马尾松纯林林窗等不同林分结构的土壤中；将MaYTTR-04菌株感染的松统中的宿存动态。JPMa1349、JPMa2049菌株在树干上的孢子，至168d仍有70％以上的萌发率(拐点萌发率，2005年1月31日～7月18日)；同一菌株在不同方位的萌发率存在一定差异，偏东方向保持拐点萌发率时间较长，JPMa1349、JPMa2049菌株分别为196d、168d；偏西方向则较短，分别为163d、147d。两个菌株70％以上萌发率平均拐点天数分别为166d和157d，差异不显著。试验前期萌发率较为整齐，标准差大多在10％以下，后期不同处理位点的萌发率差异较大。气温是影响孢子萌发的主要因子之一，树干表皮孢子萌发率随着温度升高而下降，萌发率急速下降产生拐点的日期从5月开始，6～7月份下降最快，月平均温度28℃左右是孢子萌发率下降的一个明显拐点。绿僵菌和白僵菌在树干上宿存萌发率的趋势是一致的，同一时间段萌发率不存在显著差异。 在试验地土表平均含孢量2.01×10<'8>孢子/成虫的松墨天牛成虫僵虫，经28d孢子量减少了2.14倍，至42d平均含孢量保持在7.01×10<'7>孢子/成虫，到84d后含孢量降低到5.02×10<'6>孢子/成虫水平，与成虫跗节粘取孢子量(接种量)是同一数量级。在林间126d内，各僵虫体上的孢子萌发率虽然存在显著差异，但平均萌发率均保持在90％以上；僵虫体上的孢子在接种浓度×10<'6>孢子·mL<'-1>数量级情况下，接种松墨天牛幼虫后的校正死亡率仍有45.6％。 研究了JPMa1349、MaZPTR-01菌株在不同林分土壤中的萌发率，结果表明参试的菌株都一直保持在70％以上的较高水平。孢子在土壤中经29d，数量分别下降到初始的27.8％和51.4％，在323d内保持在10<'7>孢子·g<'-1>土壤以上水平，在211d内对松墨天牛幼虫致死率和僵虫率分别仍保持在55％和45％以上。 昆虫病原菌自动携播器已获实用新型专利(专利号：ZL2005 2 009534.3.7)。本实用新型属于一种昆虫病原菌自动携播装置，它是由上部的诱捕器和下部的携播器组成。其特征在于携播器内壁上半部放有病原菌的环带，当进入携播器的昆虫通过环带逃逸时，病原菌黏附于虫体上伴随昆虫而扩散，尤其是可随小蠹类等蛀干害虫将病原菌带入树干内，使松墨天牛等在树干内部为害的幼虫感染病原菌的机会大大提高。林间试验携播器悬挂点松墨天牛幼虫感染金龟子绿僵菌僵虫率比对照高32.1％。携播器可在农林害虫防治中推广应用。 对绿僵菌遗传多样性进行了ISSR分析，结果7个ISSR引物在30个菌株中共扩增出81条带，其中76条为多态条带，多态性为93.82％，平均每个引物扩增出11.6条带。通过POPGEN软件分析发现不同绿僵菌居群间和居群内均存在一定的遗传变异。根据个体间的遗传距离进行UPGMA聚类分析，结果显示绿僵菌遗传多样性与地理来源间存在一定的相关性，但同时也发现绿僵菌个体在DNA水平上具有比较显著的遗传变异，显示出丰富的遗传多样性。 研究结果表明金龟子绿僵菌对松墨天牛具有较强致病力，在林间的宿存能力强，能够保持较长时间的生物活性。MaYTTR-04、MaYTTR-03、JPMa2049菌株今后在防治松墨天牛方面具有较大开发应用价值。MaYTTR-04菌株目前可做为生产性菌株应用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1研究文献综述

1.1绿僵菌属分类研究概况

1.2绿僵菌对昆虫致病的病理学研究进展

1.3生态学与流行病学

1.4绿僵菌资源收集及其分离方法

1.5优良菌株选育

1.6绿僵菌剂型的开发研究

1.7绿僵菌在有害生物综合治理中的应用

2本项目研究的意义

2.1松材线虫病的危害性

2.2防治松墨天牛是松材线虫病综合治理的主要手段

2.3当前治理松墨天牛的主要技术措施

2.4松墨天牛的主要病原真菌

2.5利用白僵菌防治松墨天牛的研究现状

2.6利用金龟子绿僵菌防治松墨天牛的研究现状

2.7金龟子绿僵菌在松林森林中宿存动态的研究

2.8本项研究的意义

3研究的主要内容和技术路线

3.1研究主要内容

3.2研究技术路线

第二章森林土壤金龟子绿僵菌的分离

1材料和方法

1.1土壤样品采集

1.2土样分离

1.3选择性培养基

1.4样点土壤平均成菌落数(CFU)的计算

1.5土壤pH值测定

2结果与分析

2.1分离机率

2.2不同森林类型、采样时间的分离结果

2.3土壤pH值对成菌落数的影响

2.4成菌落数

3结论与讨论

第三章金龟子绿僵菌松墨天牛优良菌株筛选

1日本森林综合研究所保存菌株的筛选

1.1材料与方法

1.2结果与分析

1.3结论与讨论

2采集分离自国内森林土壤菌株的筛选

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.3结论与讨论

第四章金龟子绿僵菌在林间的宿存动态

1孢子在林间树干上萌发率的变化动态

1.1材料与方法

1.2结果与分析

1.3结论与讨论

2绿僵菌、白僵菌孢子在树干萌发率变化动态的比较

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3结论与讨论

3绿僵菌在松墨天牛僵虫体上的宿存动态

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3结论与讨论

4绿僵菌在森林土壤中的宿存动态

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3结论与讨论

第五章昆虫病原菌(虫生真菌)自动携播器的研制与应用

1自动携播器的研制

1.1技术原理

1.2技术方案

1.3发明内容

1.4本实用新型的优点

1.5本发明的最终结果

2虫生真菌在自动携播器中的宿存动态及林间传播效果

2.1材料和方法

2.2结果与分析

2.3结论与讨论

第六章金龟子绿僵菌遗传多样性ISSR分析的初步研究

1材料与方法

1.1供试菌株及其来源

1.2菌丝体制备

1.3仪器及试剂

1.4试剂配制

1.5 DNA提取

1.6ISSR扩增反应及检测

1.7数据统计方法

1.8统计计算

2结果与分析

2.1绿僵菌基因组DNA琼脂糖检测

2.2 ISSR扩增产物的多态性

2.3遗传多样性与群体遗传变异

2.4群体间遗传关系的UPGMA聚类分析

2.5个体聚类分析

3结论与讨论

第七章研究工作的创新点

1本研究的主要创新点

2研究工作的不足之处

参考文献

附件：昆虫病原菌携播装置实用新型专利证书

致谢