虫生真菌座壳孢的分离鉴定和代谢产物的活性研究

摘要

座壳孢菌(Aschersonia)是粉虱和介壳虫的重要昆虫病原真菌。其生态适应性强、资源丰富，是研究生物多样性和系统发育很好的模式生物。目前全世界已报道了78种座壳孢，但这只是自然界座壳孢资源的一小部分。大量地分离和培养菌种资源才能有效地保存和利用资源及其基因库，因此菌株的采集和分类鉴定工作是座壳孢所有研究的基础。然而，座壳孢菌存在着杀虫速率缓慢、发生和传播受自然因素限制较大等缺点，这在很大程度上阻碍了该菌的应用。对该菌活性代谢产物的研究可为发展新型高效的真菌杀虫剂提供依据。因此，座壳孢菌资源的收集及其代谢产物的研究是该菌研究的重点，本文即针对这两个重要方面展开研究。 本研究以福建省武夷山市和建瓯市采集的65个座壳孢菌样品为研究对象，利用体视显微镜观察其子座的形状和颜色，通过切片方法获得各菌孢子大小和侧丝长度等特征的详细数据。分离纯化了形态差异较大的21株座壳孢，用斜面低温、液体石蜡和液氮保存这三种方法对分离的菌株进行了保藏。结果表明液氮保存方法最适合座壳孢菌的长期保存。通过形态观察和分生孢子、侧丝等数据分析，可以初步鉴定：Wys20和Wys29是粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis Webber)；Jos009是扁座壳孢(Aschersonia placeta Berk & Bvt)；Jos56和Jos57是布鲁门拿维安文座壳孢(Aschersonia blumenaviensis P.Henn)；Jos70是集座壳孢(Aschersonia badia Patouillard)；Wys46、Wys47和Wys48是柱形座壳孢(A.columnifera Petch)。此外，还发现Wys23和Jos78两个形态较特殊的菌株。 对上述21株座壳孢、国外馈赠的4株座壳孢菌株和1株轮枝菌(Verticilliumsp.)的LSU rDNA部分序列进行了克隆和测序，获得约0.62 kb的序列，加上GenBank已报道的11株座壳孢LSU rDNA序列共37个采用PHYLIP软件包的邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育树并利用MEGA软件包计算各菌株间的遗传距离。结果表明：从武夷山和建瓯采集来的21株座壳孢菌株间LSUrDNA的序列的遗传距离很小(0.000-0.007)，在系统发育树中聚为一组，与粉虱座壳孢最接近。通过对系统发育树和遗传距离的分析，得到以下结论：座壳孢种间的遗传差异大于种内的遗传差异；座壳孢菌株间的遗传差异与地理来源相关；LSU rDNA的序列分析可作为座壳孢菌形态鉴定的考证、差异较大的新种的鉴定和座壳孢属与其他属真菌的鉴别，但不能应用于其近似形态种和疑难种的区分。 进而选取野外抗旱性最好的菌株Jos009研究其代谢产物的抗菌活性、杀虫活性和抗菌作用机理，并比较了不同培养方式对其代谢产物活性的影响。结果表明，液体培养比固体培养更有利于活性代谢产物的产生。活性代谢产物有广谱抗细菌和病原真菌的活性，其对敏感细菌的最小抑制浓度(MICs)从37.5 μg mL-1到150μg mL-1。活性代谢产物对多种植物病原真菌均有抑制作用，这些病原真菌包括：尖镰孢黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)、黄曲霉菌(Aspergillus flavus)和尖镰孢古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense)。其中对尖镰孢古巴专化型的抑制最为显著。此外，活性代谢产物对桃蚜(Myzus persicae)也表现很强的触杀活性，24h和48h半致死浓度分别为1.025和0.714 mg mL-1。利用扫描电镜观察经代谢产物处理后的尖镰孢古巴专化型。结果表明，其代谢产物可直接作用于真菌细胞壁，产生一系列的形态畸形，包括菌丝的降解、起泡和扭曲。 采用活性追踪的方法对活性代谢产物进行分离和纯化，得到一种纯的化合物15α,22-二羟何帕烷。生物测定结果表明：15α,22-二羟何帕烷对对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种8010菌株(Bacillusthuringiensis subsp．kurstaki 8010)、沙门氏杆菌(Serratia marcescens)和粘质赛氏杆菌(Salmonella typhimurium)表现出微弱的抑制作用，MIC均为500 μgmL-1。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1虫生真菌研究历程及开发应用现状

1.1虫生真菌研究历程

1.2虫生真菌开发应用现状

2座壳孢菌的研究历程及应用现状

3座壳孢菌的分类

4座壳孢菌的生物学特性研究

5座壳孢菌的侵染机制和致病机理

6座壳孢菌的代谢产物研究

7本研究的立题依据和内容

第二章 座壳孢菌的采集、分离和分类鉴定

1材料和方法

1.1材料

1.2菌种采集

1.3菌落形态观察

1.4菌种保存和活力检测

2结果与分析

2.1菌株的编号、采集地点和时间

2.2子座形态观察

2.3座壳孢菌的分离鉴定

2.4鉴定结果分析

2.5菌种保存方法的比较

3讨论

3.1形态分析中存在的问题

3.2菌种保存方法的优劣

第三章 座壳孢菌的分子系统学研究

1材料与方法

1.1菌株

1.2培养基

1.3菌体培养和DNA提取

1.4LSU rDNA分析

2结果与分析

2.1基因组DNA的提取

2.2 LSU rDNA的PCR扩增

2.3 PCR产物的回收和纯化

2.4 LSU rDNA的克隆

2.5测序结果

2.6座壳孢菌LSU rDNA的系统发育分析

3讨论

3.1种间遗传差异大于种内遗传差异

3.2菌株间的遗传差异与地理来源相关

3.3 LSU rDNA的序列不可用于座壳孢近似形态种的区分

第四章 座壳孢菌代谢产物的提取和活性研究

1材料与方法

1.1菌种与培养基

1.2方法

2结果与分析

2.1不同培养方式所获得的代谢产物和物理化学性质

2.2抑制真菌活性

2.3抑制细菌活性

2.4座壳孢各组分代谢产物的杀虫效果

2.5座壳孢胞外代谢产物Ⅲ对桃蚜的触杀活性的LC50测定

2.6不同代谢产物生物活性的比较

2.7扫描电镜观察代谢产物Ⅱ对菌丝形态的影响

3讨论

3.1座壳孢菌代谢产物的抗菌活性和化学防御体系

3.2座壳孢菌代谢产物的杀虫活性

3.3为什么次生代谢产物对桃蚜有活性而对粉虱却没有活性?

3.4培养方式和胞内外次生代谢产物活性的区别

3.5代谢产物作用机理探讨

第五章 座壳孢菌抗菌代谢产物的分离和纯化

1材料与方法

1.1供试样品

1.2主要试剂及耗材

1.3常用培养基

1.4主要仪器

1.5供试细菌

1.6供试真菌

1.7抗菌代谢产物Ⅱ的分离纯化

1.8结构测定

1.9生物活性测定

2结果与分析

2.1抗菌代谢产物Ⅱ的分离纯化

2.2化合物C6-1结构解析

2.3化合物C5-1、C8-1、C8-2和C8-3结构解析

2.4化合物15α,22-二羟何帕烷的抗菌生物活性

2.5化合物15α,22-二羟何帕烷的晶体形态

3讨论

3.1分离方法

3.2化合物15α,22-二羟何帕烷的探讨

3.3获得高活性纯化合物是仿生合成的基础

结论和展望

参考文献

附录 座壳孢菌菌株分类特征描述

攻读博士学位期间发表的论文

致谢