番木瓜β-半乳糖苷酶同源基因启动子克隆与功能鉴定

摘要

本研究在前人对番木瓜β-GAL多基因家族研究的基础上，采用IPCR技术进行了三次步移，获得了β-GAL同源基因5'端和启动子区，并对其进行了功能鉴定，为将来采用启动子区RNAi技术研究β-GAL多基因家族的各个成员在番木瓜果实软化中的作用大小，延长番木瓜果实货价期奠定了基础。具体结论如下： 1、完成了番木瓜β-GAL同源基因5'端和启动子的克隆和序列分析。 利用IPCR技术克隆出番木瓜β-GAL同源基因5'端和启动子，并登陆GenBank，序列号为EF694758。利用在线软件Neural Netwok Promoter Prediction对基础启动子区和转录起始位点进行预测，结果发现在195-245bp，552-602bp，560-610bp和591-641bp的位置可能存在基础启动子序列。并采用启动子预测软件Plant CARE和PLACE对该序列进行分析，分析发现，其中具有大多数高等植物启动子的保守元件，并具有一些和果树成熟有关的调控元件，如ABA反应元件。 2、完成了启动子功能的初步检测。 构建了启动子缺失表达载体，通过农杆菌介导，进行了GUS瞬时检测，初步说明β-GAL同源基因启动子在番木瓜果实中具有启动功能。通过染色时间和染色程度推测：在603bp和724bp之间可能存在抑制启动的元件。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

第一章前言

1番木瓜研究的意义

1.1番木瓜的营养保健价值

1.2番木瓜生产的经济效益和社会效益

2果实软化的相关研究

2.1果实细胞壁结构的研究

2.2与果实软化相关的水解酶类研究

2.3β-GAL研究进展

3启动子

3.1启动子的结构

3.2启动子的分类

3.3启动子的研究方法

4本研究的目的意义

5本研究的技术路线

第二章番木瓜β-GAL同源基因启动子的克隆

1材料

1.1植物材料

1.2菌株和克隆载体

1.3购买的试剂、酶及药品等

1.4常用溶液试剂

1.5主要仪器和设备

2实验方法

2.1番木瓜叶片基因组DNA的提取

2.2检测所提取的DNA的质量

2.3基因组DNA的酶切及纯化

2.4自连接与纯化

2.5引物设计

2.6番木瓜β-GAL同源基因启动子的PCR扩增

2.7目的片段纯化回收

2.8 PCR目的片段与T载体的连接

2.9宿主菌E.coli DH5α感受态细胞的制备

2.10连接产物的转化

2.11　PCR检测

2.12序列的生物信息学分析

3结果与分析

3.1番木瓜基因组DNA的提取结果

3.2酶切结果

3.3 IPCR结果分析

3.4.转录起始位点和启动子调控元件的预测

第三章启动子缺失表达载体的构建

1试验材料

1.1植物材料

1.2菌株和克隆载体

l.3购买的试剂、酶及药品等

1.4常用溶液试剂

1.5主要仪器和设备

2实验方法

2.1番木瓜叶片基因组DNA的提取

2.2 pCAMBIA1301质粒的提取

2.2载体大片段的准备

2.3启动子片段的准备

2.4载体大片段与启动子片段的连接

2.5连接产物的转化E.coli DH5α

2.6阳性重组质粒的鉴定

3结果与分析

第四章.根癌农杆菌介导的GUS融合基因的瞬间表达

1试验材料

1.1植物材料

1.2菌株和克隆载体

1.3购买的试剂、酶及药品等

1.4常用溶液试剂

1.5主要仪器和设备

2试验方法

2.1农杆菌LBA4404感受态细胞制备

2.2重组质粒转化根癌农杆菌

2.3阳性菌的鉴定

2.4农杆菌的侵染

2.5 GUS融合基因的瞬间表达

3结果与分析

3.1阳性菌的鉴定

3.2 GUS融合基因的瞬间表达

第五章讨论

1番木瓜基因组DNA的分离与纯化

2 IPCR巢式引物的设计

3 IPCR结果序列的分析比对

4 IPCR的5'端定向步移

5研究展望

第六章结论

参考文献

附录

致谢