龙眼在酸雨胁迫下基因的差异表达及DHAR基因的克隆

摘要

酸雨的污染是当代国际性的重大生态环境问题，以乌龙岭龙眼成年树为材料，研究pH 2.5、3.5、5.6(对照)的模拟酸雨胁迫下龙眼叶片基因的差异表达。对龙眼叶片RNA的提取方法作出探索，以此为模板对影响DDRT-PCR扩增的重要参数进行优化试验，并建立了适合龙眼叶片的差异显示分析体系，最佳体系为：25 μl体系中RNA投入量为3.0 μg，锚定引物浓度0.8 μmol/L，随机引物浓度0.8 μmol/L，dNTP浓度200 μmol/L，Taq酶浓度1.25 U，退火温度40℃。找出一个与酸雨胁迫有关的EST序列，登录到GenBank上，其登录号为FC860625,BLASTN核苷酸同源性比较结果显示此片段与己报道的杨树叶片受干旱胁迫的EST有75％的同源性。另外，利用BLASTX蛋白质同源性查询，其可能的编码产物与葡萄上的一个未命名的蛋白产物存在66％左右的相似性，与水稻上一个假定的转录起始因子存在59％的相似性，与拟南芥ATP结合因子/RNA聚合酶Ⅱ转录因子存在39％的相似性。推测此差异片段可能是龙眼对酸雨信号感知后产生的第二信使物质激活的转录因子，引起酸雨相应基因的表达；也可能与胁迫条件下进行无氧呼吸、能量的加快消耗有关。 根据苹果、番茄、拟南芥、小麦上已克隆得到的DHAR同源基因的保守区序列，设计合成兼并引物，在龙眼叶片上克隆得到了长度为437bp龙眼中的DHAR保守区片段；利用RACE方法，根据本试验所得的DHAR cDNA保守区序列，设计3'端特异引物，克隆得到了此基因3'端的序列。推测调控抗坏血酸代谢是提高龙眼抗酸雨胁迫的一条可行途径。通过超量表达促进抗坏血酸再生的酶如DHAR的活性，可以提高龙眼体内抗坏血酸的含量，同时龙眼对酸雨的抗性可能也有一定程度的提高。

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摘要

第一章 文献综述

1龙眼在酸雨胁迫下基因的差异表达

1.1酸雨概况以及对植物影响的研究进展

1.2研究基因差异的方法:mRNA差异显示技术

1.3差民显示技术在植物逆境胁迫研究中的应用

1.4研究的意义

2.龙眼脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因的克隆

2.1抗坏血酸与环境胁迫

2.2植物脱氢抗坏血酸还原酶的研究进展

2.3本试验的目的和意义

第二章龙眼酸雨胁迫下基因的差异表达

1试验材料及方法

1.1试验材料与酸雨配置

1.2主要实验仪器、试剂

1.3.龙眼叶片RNA的提取与检测

1.4mRNA差异显示技术体系的建立

1.5回收差异条带进行二次扩增

1.6连接转化

1.7大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备-CaCl2法

1.8重组质粒的PCR检测

1.9酶切鉴定

1.10测序

2结果与分析

2.1RNA质量

2.2DDRT-PCR参数优化

2.3差异显示结果

2.4差异片段的回收、重扩增

2.5差异片段的克隆

2.6序列分析

3讨论

3.1龙眼叶片RNA提取与逆转录

3.2mRNA差异显示技术体系的建立

3.3龙眼叶片差异显示技术体系的优化结论

3.4差异结果分析

3.5差别片段的提纯与再扩增

3.6PCR产物克隆

3.7序列分析

第三章龙眼DHAR基因的克隆

1.试验材料与方法

1.1材料

1.2试验方法

1.3PCR产物的胶回收及检测,连接转化与蓝白斑筛选,重组质粒PCR检测

2.结果与分析

2.1DHAR基因cDNA中间片段的克隆

2.2DHAR基因cDNA3'端片段的克隆

2.3龙眼DHAR基因序列拼接后结果

3.讨论

3.1DHAR基因在植物抗逆方面的作用

3.2RACE技术的优化

3.3龙眼中DHAR基因功能的讨论

参考文献

附录

致谢