柚果实黄酮合成相关基因cDNA克隆及生物信息学分析

摘要

本研究利用RT-PCR和RACE技术，克隆了‘琯溪蜜柚’果实中黄烷酮-3-羟化酶(F3H)的cDNA全长以及查尔酮合成异构酶(CHI)，查尔酮合成酶(CHS)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)cDNA的保守序列。这些类黄酮合成关键基因的克隆，为柚子果实类黄酮合成机理研究奠定了分子生物学基础。研究结果如下：
　　 1．利用RT-PCR和RACE进行F3H cDNA全长的克隆
　　 F3HcDNA全长为1302bp，开放阅读框能够编码362个氨基酸（Mw=40.497kDa,pI=5.97）。利用NCBI进行基因和蛋白质Blast，结果发现F3H的cDNA全长，该序列与柳橙(Citrus sinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)、陆地棉(Gossypium barbadense)、海岛棉(Gossypium hirsutum)、葡萄(Vitisvinifera)同源性也比较高，分别为97％、87％、86％、85％、84％；蛋白质序列与柳橙(Citrus sinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)、陆地棉(Gossypium barbadense)、海岛棉(Gossypium hirsutum)、葡萄Vitisvinifera)同源性也比较高，分别为97％、87％、86％、85％、84％。对克隆基因编码蛋白质保守序列的预测，该基因包括20G-FeⅡ-Oxy高度保守区域，该结构域具有赖氨酸水解酶、异青霉素合成酶和AlkB活性，该保守结构决定了该酶具有催化类黄酮合成的功能。该序列的GenBank登录号为：GQ121373。
　　 2．利用RT-PCR和RACE进行CHI cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到CHI基因的cDNA保守片段，长度782bp，利用Blast比对软件，发现‘琯溪蜜柚’果实的CHI基因与甜橙(Citrus sinensis)、温州蜜柑家族(Citrus reticulata) CHI的cDNA基因同源性很高，达到96％、95％，与毛果杨(Populus trichocarpa)、西洋梨子(Damson pear)、草莓(Fragaria ananassa)、圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的cDNA的同源率分别为79％、78％、77％、74％、68％。编码蛋白质的保守序列发现，该基因具有Chalcone superfamily的保守序列，该保守序列与CHI基因催化类黄酮物质的合成有关。该序列的GenBank登录号为：FJ976039。
　　 3．利用RT-PCR进行CHS cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到一段长280bp的CHS基因的保守序列，该基因与野茶树的CHS基因具有较高的同源性，推测编码蛋白质保守结构域为cond-enzymes家族，属于缩合酶家族，催化类似于重排（脱羧基或者非脱羧基）反应的酶促反应。这个家族有很强的结构相似性，也参与脂肪酸的合成和降解反应，产生聚酮化合物。在类黄酮物质的合成过程中，CHS的主要功能是催化从4-香豆酸CoA和丙二酰CoA合成查尔酮的酶促反应。该序列的GenBank登录号为：GU932717。
　　 4．利用RT-PCR进行PAL cDNA保守序列的克隆
　　 克隆得到一段长875bp的PAL基因的保守序列。通过与其他植物PAL基因的比对，发现与其他一些植物具有较高的同源性。预测该基因编码的蛋白质具有一个保守结构域PAL-HAL，该结构域能催化苯基丙氨酸形成苯丙烯酸。该序列的GenBank登录号为：GQ125373。