福建省油茶主栽品种的DNA指纹鉴定

摘要

种质资源的鉴定与评价是对其有效利用的基础。从福建省南平、三明、龙岩、宁德和福州五个地区的17个县市，收集了大果油茶(Camelliachekiangoleosa)、普通油茶(Camelliaoleifera)和小果油茶(Camelliameocarpa)共50份参试材料。对11种表型特征进行表型多样性的分析，结果表明：利用传统的表型性状来研究油茶的遗传变异情况比较困难且具局限性，而分子标记是研究油茶遗传多样性和遗传分化的有效工具。通过建立和优化AFLP体系，对福建省油茶主栽品种的遗传多样性进行研究，构建了福建省这些油茶主栽品种的DNA指纹图谱，以利于今后种质资源鉴定。主要研究结果如下：
　　 1．对50份参试材料的11个表型性状进行测定和分析，各性状的平均变异系数为34.13％，变异系数最大的是鲜果重，为64.88％，叶形指数和果形指数较小，分别为14.27％和9.64％，这说明不同材料之间的鲜果重差异很大，叶形指数和果形指数是比较稳定的性状。11个表型性状的方差分析结果表明，果皮厚度的差异性最大，其F值为117.77。观测的11个性状中，果径、鲜果重、果高、叶面积和叶形指数为主要成分。11个表型性状的相关性分析结果表明：5对性状呈显著相关，27对性状呈极显著相关。果径与鲜果重的相关性最为紧密，据此建立果径-鲜果重回归方程：Y=4.952X2-15.236X+15.831。聚类分析结果表明，50份参试材料被分为4类，第一类、第二类、第三类的46号和47号是普通油茶，第三类除46号和47号外，其余13个均是小果油茶，而48号是大果油茶，单独一类，这样的聚类结果难以将各个材料鉴定出来。
　　 2．用接近成熟的油茶叶作为提取DNA的材料，用改良的CTAB.法，调整了PVP和β-巯基乙醇的用量，成功的提取出完整的基因组DNA。用EcoRI和MseI进行双酶切，结果表明，基因组DNA被酶切成弥散状，说明该DNA提取方法适用于AFLP分析。该方法克服了以往需用嫩叶作为提取材料这一限制，具有更广泛的适用性和实用性。
　　 3．建立并优化一个适合油茶的AFLP最佳反应体系。酶切体系为：DNA为150ng，EcoRI内切酶1U,MseI内切酶3U。连接体系为：DNA酶切液10μl,EcoRI接头和MseI接头各5pmol，T4-DNA连接酶7U。预扩增体系为：DNA连接液4μ1,dNTP终浓度为0.2mmol.L-1，E0+1为2pmol，M0+1为1pmol,Mg2+终浓度为2.5mmol.L-1,rTaq聚合酶1.5U。将预扩增产物稀释60倍，吸取5μ1用于下一步扩增。选择性体系与预扩增体系稍微不同，E0+3为8pmol,M0+3为3pmol。选择性扩增产物用6％的变性聚丙烯酰胺电泳，电泳后采用银染法显色。
　　 4．从64对引物组合中筛选出8对扩增性强、重复性好、带型清晰且分布均匀的引物对50份参试材料进行扩增。8对引物共扩增出313个位点，平均每对引物组合扩增39.1个位点，多态性位点151个，占总位点数的48.24％。50份参试材料中，49号和50号的遗传距离最小(0.0094)，26号和48号的遗传距离最大(0.2328)，平均遗传距离为0.1236。从种源地看，闽侯与大田的遗传距离最小(0.0412)，表明这两地种源的亲缘关系较近。聚类结果较为符合实际情况，表明AFLP技术对种质鉴定是比较准确的。
　　 5．首次将AFLP技术用于构建福建省主栽品种的DNA指纹图谱，每个材料的扩增位点各不相同，采用二岐分类法可以将供试的材料一一分开，可以根据构建的指纹图谱来鉴定各个材料。
　　 以上研究从表型、分子水平上揭示了福建省油茶主栽品种的遗传多样性，为福建省油茶种质资源的保存以及优良品种的选育积累了数据。构建的指纹图谱对油茶优良品种的鉴定极有价值，对福建省油茶主栽品种的利用具有重要意义。