香蕉枯萎病菌GFP标记和β-葡萄糖甘酶基因克隆

摘要

由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害，香蕉的生产带来严重威胁。目前，国内香蕉生产尚无有效、稳定的控制措施。深入研究香蕉枯萎病菌的致病特性和病菌的生理学、遗传学特性，对进一步研究香蕉枯萎病的发生与流行规律、研究有效的控制方法均有一定的理论意义和应用价值。
　　 本研究将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, gfp)基因转化入香蕉枯萎病菌，研究转化后菌株的生物学特性以及在香蕉植株体内的侵染特性，为进一步研究香蕉枯萎病菌致病机理和生防提供理论基础；同时克隆出香蕉枯萎病菌的β-葡萄糖甘酶基因，为研究此基因功能奠定基础。主要研究结果如下：
　　 1．香蕉枯萎病株采自福建省漳州，经单孢分离、致病性测定与分子鉴定，获得21个尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种。
　　 2．建立香蕉枯萎病菌的PEG介导原生质体法遗传转化系统，香蕉枯萎病菌的原生质体的制备是整个转化中最关键的一步，影响原生质体制备因素很多主要包括合适的酶液、菌丝的菌龄、制备原生质体的溶菌温度和溶菌时间。本文转化方法采用的是0.8mol·L-1的NaCl溶解的崩溃酶(Drislase)和溶壁酶(Lysing Enzyme)；菌龄10-14h的新鲜菌丝；28℃，70r·min-1消化酶解2-3h。
　　 3．对尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Foc-3076菌株进行gfp标记。标记后菌株的菌丝、分生孢子、厚垣孢子的形态与亲本菌株形态基本相同，且在紫外光下都呈现绿色荧光。PCR验证表明，目的基因已转入到Foc-3076菌株。且标记后菌株较之原始菌株的抗潮霉素能力大大增加。在无选择压力条件下继代培养6代，转化子仍然保持强烈的绿色荧光。gfp基因标记前后的菌株在菌落形态、最佳pH值和菌丝生长速度基本一致，菌株致病力未有明显改变，发病率均达到90％以上。
　　 4．利用激光共聚焦显微镜扫描观察结果表明，标记病原菌侵染香蕉是以孢子萌发或菌丝体从根部侵入植株体内，并沿着寄主细胞间隙扩展与蔓延，经植株的维管束组织向上生长至植株的假茎顶部。
　　 5．通过GenBank上近缘物种β-葡萄糖甘酶基因序列设计简并引物，提取尖孢镰刀菌古巴专化型Foc-3076菌株的RNA，通过RT-PCR扩增中问序列及3'RACE-PCR从Foc-3076菌株cDNA一链中克隆得到一个1473bp的β-葡萄糖甘酶基因序列。