龙眼体胚发生过程中激素代谢和信号转导相关基因的克隆与表达

摘要

本研究以龙眼（Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi）胚性愈伤组织为材料，克隆生长素信号转导相关基因（生长素受体基因、生长素结合蛋白基因和生长素应答因子基因）、乙烯生物合成关键基因（ACC合酶基因和ACC氧化酶基因）、乙烯信号转导相关基因（乙烯受体基因），并采用q-PCR分析其表达水平在龙眼体胚发生过程中的动态变化规律，以期为进一步了解激素在龙眼体胚发生中的调控机制奠定基础。主要研究结果如下：
　　 1.龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的克隆
　　 采用RT-PCR结合RACE方法，克隆得到龙眼胚性愈伤组织生长素信号转导相关基因3个：①龙眼胚性愈伤组织生长素受体基N（DL-TIR1，GenBank GQ870264），2328 bp的cDNA全长序列包含一个长为1761 bp的ORF，并包含5’-UTR为118 bp，3’-UTR为449 bp，3’poly（A）尾长16 bp；②龙眼胚性愈伤组织生长素结合蛋白基因（DL-ABP1，GenBank GQ900592），869 bp的cDNA全长序列包含一个长为567 bp的ORF，并包含5’-UTR为43 bp，3’-UTR为259 bp，3'poly（A）尾长19 bp；③龙眼胚性愈伤组织生长素应答因子基因（DL-ARF，GenBankGQ923778）：2695 bp的cDNA全长序列包含一个长为2046 bp的ORF，并包含5'-UTR为163 bp，3'-UTR为486 bp，3’poly（A）尾长17 bp。同时，还克隆了乙烯合成相关基因和乙烯受体基因各2个：①龙眼胚性愈伤组织ACC（乙烯合成前体）合酶基因（DL-ACS，GenBankFJ617537），1817 bp的cDNA全长序列包含一个长为1437 bp的ORF，并包含5’-UTR为73 bp，3'-UTR为307 bp，3’poly（A）尾长16 bp；②龙眼胚性愈伤组织ACC（乙烯合成前体）氧化酶基因（DL-ACO，GenBank FJ534854），1315 bp的cDNA全长序列包含一个长为948bp的ORF，并包含5’-UTR为86 bp，3'-UTR为281 bp，3’poly（A）尾长13 bp，DNA扩增序列长为1660 bp（GenBank GU123929），包含3个内含子，内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则；③龙眼胚性愈伤组织乙烯受体基因（DL-ETR1，GenBankFJ513322），2611 bp的cDNA全长序列包含一个长为2223 bp的ORF，并包含3’-UTR为388 bp，3'poly（A）尾长24 bp；④龙眼胚性愈伤组织乙烯受体基因（DL-ERS1，GenBank FJ513323），2259 bp的cDNA全长序列包含一个长为1911 bp的开放阅读框，并包含3’-UTR为348 bp，3’poly（A）尾长17 bp，DNA扩增序列长为2236 bp（GenBank GU123930），包含2个内含子，内含子的剪切位点符合“GT-AG”规则。
　　 2.龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的生物信
　　 龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的生物信息学分析结果表明：生长素信号转导基因：①DL-TIR1基因，编码586个氨基酸，属亲水蛋白，含有3个跨膜结构，36个功能位点，1个F-box结构域，α螺旋是其主要的二级结构，亚细胞定位在细胞质中，与不同植物来源的TIR1的同源性为57％-85％，DL-TIR1可能通过N端的F-box结构域参与龙眼体胚生长素调控的SCFDL-TIR1-Aux/IAAs结合，将Aux/IAAs通过泛素化途径降解，开启生长素信号途径；②DL-ABP1基因，编码188个氨基酸，属亲水蛋白，含有1个跨膜结构，7个功能位点，属于Auxin-binding protein家族，无规则卷曲是其主要的二级结构，在N端前22个氨基酸是信号肽，亚细胞定位在内质网中，与不同植物来源的ABP1的同源性较高为72％-87％，推测DL-ABP1通过另一条与DL-TIR1所介导的基因调控相平行的细胞学信号传递途径参与龙眼体胚所涉及的生长素诱导的快速反应；③DL-ARF编码681个氨基酸，属亲水蛋白，含有2个跨膜结构，36个功能位点，2个保守结构域，属于Transcriptional factor B3家族，无规则卷曲结构是其主要的二级结构，亚细胞定位在细胞核中，与不同植物来源的ARF的同源性为41％-81％，DL-ARF可能属于转录抑制因子，在龙眼体胚中功能需要进一步探索。
　　 乙烯合成相关基因：①DL-ACS基因，编码478个氨基酸，属亲水蛋白，含有2个跨膜结构，21个功能位点，3个保守结构域及1个化学反应结合位点，属于ACC Synthase家族，无规则卷曲是其主要的二级结构，有1个卷曲螺旋，亚细胞定位在细胞核中，与不同植物来源的ACS的同源性为63％-77％，DL-ACS可能响应龙眼体胚基础乙烯的合成；②DL-ACO编码315个氨基酸，属亲水蛋白，有8个功能位点，含有1个Oxoglutarate/iron-dependent oxygenase结构域，无规则卷曲是其主要的二级结构，有1个卷曲螺旋，亚细胞定位在细胞质中，与不同植物来源的ACO的同源性为47％-86％，DL-ACO可能响应龙眼体胚基础乙烯的生成。
　　 乙烯信号转导基因：①DL-ETR1基因，编码740个氨基酸，属疏水蛋白，含有3个跨膜结构，有28个功能位点，8保守个结构域，属于Signal transduction histidine kinase，hybrid-type，ethylene sensor家族，α螺旋是其主要的二级结构，有1个卷曲螺旋，亚细胞定位在质体中，与不同植物来源的ETR1的同源性为63％-91％，DL-ETR1在龙眼体胚乙烯受体家族中占有突出的功能地位，高度保守的DL-ETR1-Cys65可能与乙烯受体活性和乙烯敏感性相关的；②DL-ERS1基因，编码636个氨基酸，属疏水蛋白，含有4个跨膜结构，有25个功能位点，6个保守结构域，α螺旋是其主要的二级结构，有1个区域卷曲螺旋，亚细胞定位在细胞质中，与不同植物来源的ERS1的同源性为36％-80％，DL-ERS1和DL-ETR1可能在龙眼体胚乙烯信号转导上具有相似的生物学特性，不过在信号转导量上有不同。
　　 3龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的定量表达分析
　　 3.1龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的定量表达情况
　　 生长素信号转导基因：①DL-TIR1在龙眼体胚的8个阶段均有表达，整个变化趋势呈不规则字母“W”状，子叶形胚（Stage8）的表达量最高；②DL-ABP1在龙眼体胚的各阶段均有表达，整体转录水平的变化趋势呈不规则的“W”状，松散型胚性愈伤组织（Stage1）、不完全胚性紧实结构（Stage3）、子叶形胚（Stage8）表达量相对较高，球形胚（Stage5）的表达量最低；③DL-ARF整体转录水平的变化趋势呈不规则的“M”状，松散型胚性愈伤组织（Smge1）、球形胚（Stage5）、子叶形胚（Stage8）的表达量相对较低，胚性愈伤组织Ⅱ（Stage2）、不完全胚性紧实结构（Stage3）、心形胚（Stage6）的表达量相对较高。
　　 乙烯合成相关基因：①DL-ACS相对表达量变动态变化存在较大的时期差异，球形胚（Stage5）的表达量最高，鱼雷形胚（Stage7）的表达量最低；②DL-ACO表达量整体的变化趋势呈字母“M”状，不完全胚性紧实结构（Stage3）和心形胚（Stage6）分别出现了峰值，松散型的胚性愈伤组织（Stage1）、球形胚（Stage5）以及子叶形胚（Stage8）的表达量相对较低。
　　 乙烯信号转导基因：①DL-ETR1表达量整体的变化趋势呈不规则“W”状，松散型的胚性愈伤组织（Stage1）的表达量最高，心形胚（Stage6）阶段的表达量最低；②龙眼体胚发生过程的8个阶段均有DL-ERS1基因的表达，但除了子叶形胚（Stage8）其它7个阶段的表达量都很低，子叶形胚（Stage8）的表达量最高，鱼雷形胚（Stage7）的表达量极低，几乎不表达。
　　 3.2龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因表达情况相互之间的联系
　　 作为“可能”生长素受体之一的DL-4BP1基因整体转录水平的变化趋势与生长素受体DL-TIR1基因相似。乙烯生物合成途径中DL-ACS处于DL-ACO的上游，但两者的转录水平呈现出几乎完全相反的动态变化趋势。同为乙烯受体家族I的DL-ETR1与DL-ERS1有着不同的表达模式。生长素受体DL-TIR1和乙烯合成相关基因DL-ACS两者的变化趋势基本相似。内源IAA的整个变化趋势和DL-ACD基因的转录水平的变化趋势都呈双峰型，只是IAA的两峰值出现的时间比DL-ACO的转录水平稍提早了一个阶段。与生长素信号转导相关的DL-ARF基因与乙烯生物合成相关的DL-ACO整体转录水平的变化趋势均呈不规则的“M”状，第一个表达峰出现DL-ARF比DL-ACO稍早一个阶段，DL-ACO表达量会比DL-ARF稍高。龙眼体胚中，DL-ARF、DL-ACO是否是生长素和乙烯互作的交叉点，值得我们进一步深入探索。
　　 总之，本研究首次在龙眼上克隆与生长素和乙烯密切相关的7个基因，对其结构和功能进行了预测，研究了基因在体胚发生过程中的表达规律，并且首次在木本体胚中探讨生长素和乙烯的互作，有助于今后对龙眼体胚激素作用机制的更深入探索，也为龙眼遗传改良提供目的基因资源。

目录

文摘

英文文摘

缩写词

第一章 引言

1 植物体胚发生的特点和意义

2 植物激素对体胚发生的诱导和调节研究进展

2.1 生长素对植物体胚的调节作用

2.2 细胞分裂素对植物体胚的调节作用

2.3 生长素与细胞分裂素对植物体胚的调节作用

2.4 脱落酸对植物体胚的调节作用

2.5 乙烯对植物体胚的调节作用

2.6 植物体胚发生过程中内源激素的变化

2.7 植物激素对体胚调控的机理

3 植物激素的代谢与信号转导研究进展

3.1 生长素的代谢与信号转导

3.2 细胞分裂素的代谢与信号转导

3.3 赤霉素的代谢与信号转导

3.4 脱落酸的代谢与信号转导

3.5 乙烯的代谢与信号转导

3.6 不同植物激素信号途径中的共性

3.7 五大类激素代谢和信号转导的相互联系

4 激素代谢与信号转导相关基因的研究进展

4.1 生长素受体TIR1/AFBs

4.2 生长素结合蛋白ABP1

4.3 生长素应答因子ARF

4.4 乙烯前体ACC合成酶

4.5 乙烯前体ACC氧化酶

4.6 乙烯受体ETR1和ERS1

5 生物信息学在基因克隆中的应用

6 实时荧光定量PCR在体胚上的应用

7 龙眼体胚发生研究进展

8 本研究的意义和主要内容

第二章 龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的克隆

第一节 龙眼胚性愈伤组织生长素受体基因(TIR1)的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 龙眼胚性愈伤组织生长素结合蛋白基因(ABP1)的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 龙眼胚性愈伤组织生长素反应因子基因(ARF)的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四节 龙眼胚性愈伤组织ACC合成酶基因(ACS)的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五节 龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因(ACO)的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六节 龙眼胚性愈伤组织两个乙烯受体基因的克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的生物信息学分析

第一节 龙眼胚性愈伤组织生长素受体基因(TIR1)的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 龙眼胚性愈伤组织生长素结合蛋白基因(ABP1)的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三节 龙眼胚性愈伤组织生长素应答因子基因(ARF)的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四节 龙眼胚性愈伤组织ACC合酶基因(ACS)的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五节 龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因(ACO)的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六节 龙眼胚性愈伤组织乙烯受体基因(ETR1)的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第七节 龙眼胚性愈伤组织乙烯受体基因(ERS1)的生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的定量表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 小结

1 龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的克隆

2 龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的生物信息学分析

3 龙眼体胚发生过程中激素代谢与信号转导相关基因的定量表达分析

参考文献

附录1

附录2

附录3

附录4

附录5

附录6

附录7

附录8

附录9

附录10

附录11

致谢