红麻骨纤维质转化燃料乙醇的关键技术研究

摘要

利用地球上储量最大的可再生的植物纤维质转化制备燃料乙醇可减少温室效应、缓解能源紧张、提高环境质量、促进经济和社会的可持续发展。红麻是一种传统的速生高产的纤维作物，每公顷生物质产量可达30 t，是树木的3～4倍，对CO2的同化能力是树木的4～5倍，已被美日等发达国家认定是最适于替代木材的优质造纸植物。红麻耐旱、耐盐碱，沿海盐碱地、内陆山地旱地等均可种植，其生产不与粮争地，并可改良土壤质量，从而充分利用全国各地的边际性土地，提高土地利用率。其秸秆纤维质含有丰富的纤维素和半纤维素，用于转化燃料乙醇，具有重大的社会及经济意义。制约红麻纤维质乙醇发展的瓶颈主要是预处理技术、纤维素酶成本及木糖发酵技术。鉴此，本研究拟从高效预处理、红麻纤维素降解菌及木糖发酵菌的筛选和选育入手，以红麻秸秆纤维质为原料，研发红麻纤维质燃料乙醇的生产工艺。主要研究结果如下：
　　 1.测定了红麻秸秆纤维质的有机成分含量，其中含纤维素42.31％、半纤维素22.58％、木质素23.79％。采用热水和3％硫酸、1.5％烧碱溶液对红麻秸秆进行预处理(121℃，60 min)，通过纤维素酶催化水解，红麻秸秆的平均纤维素转化率分别达到12.23％、25.62％和85.34％，说明碱性预处理比较适合于红麻秸秆。以碱处理红麻秸秆为底物的同步糖化发酵实验表明，当发酵168 h后，乙醇浓度达到26.06 g·L-1，乙醇产率达到理论产率的76.71％。
　　 2.为研究微生物法预处理对红麻纤维质转化燃料乙醇效率的影响，采用白腐真菌Pleurotus sajor-caju在红麻秸秆培养基上固态培养的方法对红麻纤维质进行预处理，研究微生物法预处理的红麻纤维质中木质素的降解及后续的红麻纤维质酶促糖化和发酵。经P.sajor-caju培养25～35 d后，可有效去除红麻纤维质中的木质素，去除率最高可达50.20％，并提高红麻纤维素的酶促水解(糖化率达69.33～78.64％)，但采用P.sajor-caju培养物的粗酶提取液不能有效预处理红麻秸秆。以微生物法预处理的红麻秸秆样品为底物的同步糖化发酵实验表明，发酵72 h，发酵液中乙醇浓度达到18.35～18.90 g·L-1，最高乙醇产率达到理论产率的68.31％。
　　 3.筛选到一株红麻纤维质高效降解菌Trichoderma sp.HC-35，经诱变后，选育得到突变株Trichoderma sp.MHC-18，该菌株在适宜条件下固态发酵，得到的纤维素酶的FPA达29 U·mL-1，CMCase活性最高可达260 U·mL-1，较之出发菌株提高近1倍。连续5代发酵产酶，其纤维素酶活性相对比较稳定，说明该菌株具有较好的遗传稳定性。
　　 4.通过对培养基成分和发酵条件的单因子分析，初步配成MHC-18的固态发酵产酶培养基：将红麻秸秆与麸皮的混合物(7:3，w/w)以(NH4)2SO4和MgSO4的混合溶液((NH4)2SO4为25 g·L-1，MgSO4为0.5 g·L-1，用HCl溶液将pH调至5.0～6.0)调整湿度至60％～75％。接种适量孢子，在25～30℃培养5～7 d，CMCase和FPA可达最高值，其置信度95％的置信区间分别为239.67～279.31 U·mL-1和24.33～39.29 U·mL-1。MHC-18纤维素酶的适宜反应温度为45℃～60℃，最适温度为50℃，适宜pH为4.5～6.0，最适pH为5.0。但以溶液形式贮存时，稳定性较差，4℃低温条件下可保存72 h。而且，该菌株的纤维素酶系不完整，β-glucosidase活性较低。
　　 5.由于A.niger纤维素酶的β-glucosidase活性较高，酶解反应条件与MHC-18纤维素酶基本一致，可将MHC-18与A.niger两种菌株应用于固态混菌发酵。先接种MHC-18，后接入A.niger，二者接种间隔时间为24 h，在28℃下培养，总发酵时间为120 h，此时纤维素酶各组分均能达到较高的活性。
　　 6.利用红麻纤维质为主要碳源，通过正交实验，得到了MHC-18与A.niger固态混菌发酵产纤维素酶的优化培养基：红麻秸秆与麸皮的质量比为7:3，混合溶液中(NH4)2SO4浓度为25 g·L-1、MgSO4浓度为3.5 g·L-1、KH2PO4浓度为7 g·L-1，调整培养基湿度为60％～75％，起始pH5.0～6.0。在该优化培养基发酵5 d，FPA、CMCase和β-glucosidase活性分别达到35.72～46.44 U·mL-1、320.22～384.67 U·mL-1、197.44～229.86 U·mL-1(置信度为95％)。
　　 7.筛选到1株可利用木糖发酵产乙醇的酵母菌RX-8，该菌的木糖发酵为微好氧发酵。发酵培养基中木糖为50 g·L-1，蛋白胨为5 g·L-1，酵母粉为3 g·L-1，接种量为10％，28℃以120 r/min摇瓶发酵3 d，发酵液中乙醇浓度可以达到10.46～11.70μL·mL-1(置信度95％)，乙醇产率达到理论产率的33.37％。
　　 8.木糖发酵菌RX-8以葡萄糖为碳源发酵产乙醇时，发酵培养基中葡萄糖为120 g·L-1，蛋白胨为5 g·L-1，酵母粉为3 g·L-1，接种量为10％，28℃以120 r/min摇瓶发酵3 d，发酵液中乙醇浓度可达55.68μL·mL-1，乙醇产率达71.67％，表现出较高的葡萄糖发酵性能及糖耐受力。预示RX-8具有同时发酵葡萄糖和木糖的能力，有应用于纤维质乙醇的潜在工业价值。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

第一章 综述

1 燃料乙醇概况

1.1 国内外燃料乙醇的发展

1.2 燃料乙醇的原料选择

2 纤维质原料的组成

2.1 纤维素的结构与性质

2.2 半纤维素的结构与性质

2.3 木质素的结构与性质

3 纤维质原料的水解处理工艺

3.1 酸水解工艺

3.2 酶水解工艺

4.燃料乙醇酶水解工艺中纤维质原料的预处理

4.1 物理法预处理

4.2 化学法预处理

4.3 物理-化学处理法

4.4 生物预处理法

5.纤维素酶

5.1 纤维素酶的性质

5.2 纤维素酶的分子结构

5.3 纤维素酶的生产

6.木糖发酵

6.1 木糖发酵菌种及产乙醇的机理

6.2 木糖发酵的基因工程菌

7 基于酶水解的燃料乙醇生产工艺

7.1 分别水解和发酵工艺

7.2 同时糖化和发酵工艺

7.3 同时糖化和共发酵工艺

7.4 联合生物加工工艺

8 红麻的综合利用

9 本研究的目的、意义及拟解决的关键问题

9.1 研究目的

9.2 研究意义

9.3 立论依据

9.4 本研究拟解决的关键问题

第二章 理化法预处理红麻秸秆发酵转化燃料乙醇

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 培养基

1.3 菌种制备

1.4 红麻秸秆的预处理

1.5 红麻秸秆的酶促水解

1.6 同步糖化发酵

1.7 分析方法

2 结果与分析

2.1 不同处理方法对红麻秸秆组分变化的影响

2.2 处理方法和纤维素酶添加量对红麻秸秆的酶促水解的影响

2.3 红麻秸秆同步糖化发酵制备乙醇

3 讨论

3.1 红麻秸秆预处理方法的选择

3.2 红麻秸秆的同步糖化发酵产乙醇

4 小结

第三章 生物法预处理红麻秸秆发酵转化燃料乙醇

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 培养基

1.3 菌种制备

1.4 红麻秸秆的生物预处理

1.5 红麻秸秆纤维质的酶促水解

1.6 红麻秸秆的同步糖化发酵

1.7 分析方法

2 结果与分析

2.1 微生物法预处理对红麻秸秆成分的影响

2.2 微生物法预处理对红麻秸秆的酶促水解的影响

2.3 P.sajor-caju培养物粗提酶液对红麻秸秆的预处理效果

2.4 红麻秸秆同步糖化发酵制备乙醇

3 讨论

3.1 红麻纤维质的微生物法预处理

3.2 预处理方法的不足之处及改进

3.3 预处理技术的发展方向

4 小结

第四章 红麻纤维质降解菌的选育及发酵特性

1 材料与方法

1.2 纤维素酶高产菌的筛选

1.3 纤维素酶粗酶液的制备

1.4 纤维素酶高产菌的诱变选育

1.5 纤维素酶高产菌的发酵特性

1.6 酶活力测定

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的分离筛选

2.2 菌株HC-35的初步鉴定

2.3 纤维素酶高产菌Trichoderma sp.HC-35的诱变选育

2.4 产酶培养基成分对MHC-18产纤维素酶的影响

2.5 发酵条件对MHC-18产纤维素酶的影响

2.6 MHC-18纤维素酶的酶学性质研究

3 讨论

3.1 关于红麻纤维质高效降解菌的筛选

3.2 关于红麻纤维质高效降解菌的诱变选育

3.3 关于MHC-18固态发酵及其酶学性质

4 小结

第五章 红麻纤维质混菌发酵产纤维素酶的研究

1 材料与方法

1.1 红麻秸秆样品制备

1.2 培养基

1.3 孢子悬浮液制备

1.4 固态混菌发酵产纤维素酶

1.5 酶活力测定

1.6 数据处理

2 结果与分析

2.1 A.niger纤维素酶的酶学性质

2.2 MHC-18与A.niger纤维素酶的生长相容性

2.3 MHC-18与A.niger的固态混菌发酵

3 讨论

4 小结

第六章 木糖发酵菌种的选育及发酵特性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 木糖发酵菌的筛选流程

1.3 生长曲线测定

1.4 耐酒精性测定

1.5 木糖发酵菌的发酵

1.7 分析方法

2 结果与分析

2.1 木糖发酵菌种的分离筛选

2.2 木糖发酵菌RX-8的生长曲线

2.3 木糖发酵菌RX-8的耐酒精度测定

2.4 木糖发酵菌RX-8的发酵条件

3 讨论

4 小结

第七章 总结与展望

1 总结

2 本研究的特色与创新

3 展望

参考文献

附录1.标准曲线

附录2.常用溶液

致谢

攻读博士期间发表的论文