F1F0-ATP合成酶β亚基与肿瘤相关性的初步研究

摘要

过去认为F1F0—ATP合成酶只表达定位在线粒体膜上，但近年来越来越多的研究发现其亚基也分布在一些细胞的细胞质膜上，称为质膜异位F1F0—ATP合成酶。许多肿瘤细胞表面都存在F1F0—ATP合成酶，但是不同肿瘤细胞表面F1F0—ATP合成酶的量不同。F1F0—ATP合成酶β亚基的功能性单克隆抗体能够增强癌细胞及其耐药株对化疗药物的敏感性。本文旨在研究F1F0—ATP合成酶β亚基在肿瘤细胞中的定位及其表达量差异对细胞增殖的影响，进一步探讨肿瘤细胞膜表面表达F1F0—ATP合成酶的功能。
　　 为研究F1F0—ATP合成酶β亚基在肿瘤细胞中的定位，我们利用荧光标记载体使β亚基带有荧光标签。从细胞中提取总RNA，反转录得到cDNA第一链，通过PCR扩增atp5b基因，克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，转染细胞后，荧光显微镜下观察发现细胞表面确实有荧光存在。
　　 为研究F1F0—ATP合成酶β亚基表达量差异对细胞增殖的影响，我们设计了3个shRNA片段干扰ATP5B蛋白的表达，转染细胞后分别在正常条件和缺氧条件下培养，MTT法检测细胞增殖能力，发现shRNA1、shRNA2组细胞增殖率大于1，shRNA3组细胞增殖率小于1。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词表

1 引言

1.1 F1F0-ATP合成酶研究现状

1.1.1 F1F0-ATP合成酶的结构

1.1.2 F1F0-ATP合成酶的基因组成

1.1.3 F1F0-ATP合成酶的分布

1.1.4 β-F1-ATPase生物学特性

1.2 基因功能研究方法

1.2.1 基因转染技术

1.2.2 RNA干扰技术

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 细胞株、菌株及质粒

2.1.2 引物

2.1.3 药品与试剂

2.1.4 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 细胞总RNA提取

2.2.2 目的基因获得

2.2.3 pEGFP-N1-atp5b的构建

2.2.4 atp5b基因shRNA表达载体的构建

2.2.5 pCDNA3.1-atp5b重组质粒构建

2.2.6 脂质体转染(24孔板)

2.2.7 细胞蛋白质提取

2.2.8 BCA法测定蛋白浓度

2.2.9 AFB1处理Chang liver细胞

2.2.10 Western bloting

2.2.11 MTT法检测细胞增殖能力

3 结果与分析

3.1 pEGFP-N1-atp5b表达载体构建及在细胞中的表达

3.1.1 细胞总RNA提取结果

3.1.2 atp5b基因PCR扩增

3.1.3 pEGFP-N1-atp5b重组质粒构建

3.1.4 pEGFP-N1-atp5b重组质粒的真核表达

3.2 ATP5B蛋白在不同细胞中表达量分析

3.2.1 细胞蛋白提取结果

3.2.2 Western blot检测ATP5B蛋白表达情况

3.2.3 AFB1对ATP5B蛋白表达的影响

3.3 RNA干扰atp5b基因表达对细胞增殖的影响

3.3.1 atp5b基因shRNA表达质粒构建结果

3.3.2 shRNA对细胞增殖的影响

3.3.3 shRNA对细胞克隆形成的影响

3.4 atp5b基因过表达载体构建及表达

3.4.1 atp5b基因PCR扩增

3.4.2 pCDNA3.1B-atp5b重组质粒构建

3.4.3 atp5b基因过表达对细胞增殖的影响

4 讨论

4.1 ATP5B在细胞中定位表达

4.2 ATP5B蛋白在不同细胞中表达量差异

4.3 靶向atp5b基因的shRNA对细胞增殖的影响

4.4 ATP5B过表达载体构建及表达

5 结论

5.1 重组质粒转染细胞

5.2 shRNA诱导基因沉默表达

参考文献

致谢

附录