番鸭小鹅瘟病免疫荧光诊断方法的建立及应用

摘要

小鹅瘟病是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)感染1月龄以内雏鹅和雏番鸭,引起拉稀和小肠形成栓塞为特征的一种传播快、死亡率高的高度接触性传染病。该病常与番鸭细小病毒病混合感染,根据流行病学、临床症状和病理变化难以确诊,因此,研制简便快速的诊断方法对本病确诊具有重要意义。
　　 采用透析法将抗GPV单抗标记上异硫氰酸荧光素(FITC),研制出GPV直接荧光抗体试剂,建立了检测GPV抗原的直接免疫荧光检测方法(DFA)。该方法特异性强(仅与GPV反应,对MPV、MDRV、PMV等均无交叉反应)、敏感性高(最佳工作浓度为1:150,1:450倍稀释仍对抗原敏感)、快速检测(60分钟内结果)和重复性好等特点。该方法与病毒分离法和间接荧光法(IFA)比较,符合率分别为100％和95.％,三者总符合率为95.％。应用DFA检测GPV在人工感染番鸭的第3天,第5天,第7天和第10天各器官中病毒的动态分布结果表明,感染早期在心、肝、脾、肾、胰腺、盲肠扁桃体均为强阳性；感染后期在心、肝、脾呈弱阳性,在胰腺和盲肠扁桃体呈强阳性。进一步证实了DFA方法特异性好,可用于番鸭小鹅瘟病的临床快速诊断和GPV抗原在组织中的定位。

目录

文摘

英文文摘

综述

1 GPV病原学

1.1 GPV的分类学地位

1.2 GPV形态与理化特性

1.3 GPV的培养特性

1.4 GPV的分子生物学

1.5 GPV的流行病学

1.6 GPV的临床症状

1.7 GPV病理剖检

2 GPV的防治

2.1 GPV弱毒苗

2.2 GPV灭活苗

2.3 GPV基因工程疫苗

2.4 GPV抗血清

2.5 GPV卵黄抗体

2.7 GPV单抗

3 小鹅瘟病诊断技术

3.1 免疫学诊断法

3.2 分子生物学诊断方法

4 以单克隆抗体为核心建立的免疫荧光技术在GPV检测中的应用

4.1 单克隆抗体技术

4.2 免疫荧光技术检测方面的优势

5 研究目的和研究内容

第一章 抗GPW杂交瘤细胞的复苏和单抗制备

1 材料与方法

1.1 病毒和杂交瘤细胞株

1.2 实验动物

1.3 主要试剂

1.4 常用试剂的配制(见附录1)

1.5 主要仪器和设备(见附录2)

1.6 杂交瘤细胞株的复苏

1.7 细胞的冻存

1.8 小鼠腹水的制备

1.9 冰冻切片的准备

1.10 间接免疫荧光试验(IFA)

1.11 腹水特性分析

2 结果

2.1 杂交瘤细胞株的复苏

2.2 GPV单抗IFA效价测定:

2.3 GPV单抗特异性

3 结论

4 讨论

4.1 影响杂交瘤细胞复苏的因素

4.2 影响腹水产量和质量的因素

第二章 GPV单抗的荧光标记及直接荧光诊断方法的建立

1 材料与方法

1.1 病毒和单抗

1.2 主要试剂及其配制

1.3 FITC单抗的研制

1.4 病毒感染细胞板的制各

1.5 感染组织冰冻切片的制备

1.6 间接免疫荧光试验(IFA)

1.7 直接免疫荧光试验(DFA)

1.8 GPV荧光抗体的特性测定

1.9 DFA与IFA符合率比较

2 结果

2.1 单抗的蛋白浓度

2.2 荧光抗体的鉴定

2.3 保存期测定

3.结论

4 讨论

4.1 影响标记的因素

4.2 直接荧光法与其它检测小鹅瘟常用方法的比较

第三部分 应用DFA检测GPV在番鸭体内的动态分布

1 材料与方法

1.1 病毒和试剂

1.2 常用试剂的配制(见附录1)

1.3 主要仪器和设备(见附录2)

1.4 GPV人工感染试验

1.5 感染组织冰冻切片的制备

1.6 直接免疫荧光(DFA)试验

2 结果

2.1 临床症状与病理剖检

2.2 DFA检测GPV在番鸭体内的动态分布

2.3 DFA检测GPV在病死番鸭体内的分布

2.4 DFA检测GPV在番鸭各个器官中的分布率

3 结论与讨论

3.1 GPV在各个组织中的分布规律

3.2 DFA检测GPV最佳靶器官

第四章 DFA、IFA和VI三种检测GPV方法的比较

1 材料与方法

1.1 病毒和抗体

1.2 常用试剂的配制(见附录1)

1.3 主要仪器和设备(见附录2)

1.4 人工感染试验

1.5 感染组织冰冻切片的制备

1.6 间接免疫荧光试验(IFPA)

1.7 直接免疫荧光试验(DFA)

1.8 病毒分离(VI)

2 结果

2.1 病毒分离(VI)结果

2.2 DFA和IFA检测结果

2.3 DFA、IFA与VI符合率的比较

3 讨论与分析

3.1 DFA和IFA两种方法的比较

3.2 DFA和VI两种方法的比较

4 结论

参考文献

附录1 :常用试剂配制

附录2 :主要仪器设备

附录3 英文缩写词表

致谢