番鸭白细胞介素-6基因的克隆与序列分析

摘要

白细胞介素-6(1L-6)是机体内一种具有多种功能的细胞因子。IL-6是一种糖蛋白,它是通过一种受体复合物而起作用的,此受体复合物由特殊的IL-6受体蛋白(IL-6R)和信号转导亚单位蛋白gp130(CD130)组成。IL-6可以诱导双向激酶(JAK)的信号传递活性,进而激活信号转导和转录激活因子(STAT),间接地诱导相关基因转录表达。IL-6有两个主要特性:(1)可由多种细胞产生。正常情况下,骨髓质细胞,T淋巴细胞,B淋巴细胞,纤维细胞等可以产生IL-6,而在局部组织部位,IL-6则主要由成纤维细胞和巨噬同时,IL-6的产生还受某些刺激物的调控细胞产生,但是当机体发生病变时,单核巨噬细胞却是能够最早产生IL-6的反应细胞；(2)多种刺激均能诱生。炎症相关的细胞因子、细菌产物、病毒感染以及三种信号信号转导途径(甘油二醛、cAMP和Ca2+激活)任何一个被激活,均能诱生IL-6。IL-6R以膜受体形式仅在肝细胞,中性粒细胞,IL-6具有多种生物学活性,主要包括调节免疫应答、诱导急性期蛋白、调节造血系统、调节神经内分泌系统、调节肿瘤生长等。由于IL-6细胞因子可以影响抗体的总亲和力,而亲和力可以显著影响抗体的生物学效应,因此在制备疫苗时,IL-6可能是一种非常重要的天然佐剂。
　　 参考GenBank中发表的绿头鸭IL-6(AB191038)基因序列,设计并合成一对特异性引物,以番鸭脾脏中提取的mRNA为模板,用RT-PCR试验方法扩增出一条322 bp大小的目的片段。目的产物纯化后进行测序,其测序序列与绿头鸭(AB191038)同源性为99.7％。分析结果初步证实该序列为番鸭IL-6基因序列。在此测序序列基础上利用cDNA末端扩增技术(RACE技术)对序列的两端进行末端扩增,分别得到大小为447 bp的3’端未知序列和大小为455 bp的5’端未知序列。将其与已知序列拼接后得到大小为1232 bp的番鸭IL-6 cDNA基因序列,序列的5’端为G-C高富集区,G-C含量高达80％。与GenBank中发表的绿头鸭IL-6(AB191038)基因序列同源性达90.3％,与原鸡(HM179640.1)同源性为81.1％。此番鸭IL-6基因片段包含一个完整的开放阅读框,大小为804bp,共编码267个氨基酸组成的蛋白质。与绿头鸭IL-6基因序列推导的氨基酸序列相比,绿头鸭第37位氨基酸位点发生变化:His→Arg(碱性氨基酸)。空间结构分析表明,氨基酸位点的变化引起了疏水性以及相应的抗原位点均发生了变化。
　　 根据RACE试验得到的番鸭IL-6的编码区基因序列重新设计特异性引物,预期扩增片段大小为804 bp。试验以番鸭脾脏中的mRNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出699 bp大小的基因片段,测序后与预期的基因片段相比,预期的基因序列中第253-351位核苷酸在克隆后发生缺失,缺失序列主要位于5’G-C高富集区。序列分析显示,测序序列与绿头鸭(AB191038)IL-6基因序列的同源性达90％,与原鸡(HM367074.1)IL-6基因序列同源性达88％,证实此基因序列来源于番鸭IL-6基因片段。为番鸭IL-6分子生物学方面的深入研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 综述

1 细胞因子

1.1 细胞因子概述

1.2 细胞因子生物学功能

1.3 细胞因子的免疫学研究

2 白细胞介素

2.1 白细胞介素的来源

2.2 白细胞介素的分类及结构

2.3 白细胞介素的生物学功能

3 IL-6的研究进展

3.1 IL-6的来源及生物学活性

3.2 IL-6的结构

3.3 IL-6受体与信号传导

3.4 IL-6基因的克隆

3.5 IL-6在畜禽业中的应用前景

4 RACE实验技术进展

4.1 5’RACE研究进展

4.2 3’RACE试验进展

5 本试验的研究意义

第二部分 研究报告

1 试验材料

1.1 试验动物

1.2 质粒和菌株

1.3 试验试剂

1.4 主要试验仪器设备

1.5 主要溶液的配制

2 试验方法

2.1 番鸭IL-6基因序列的测定

2.2 RACE试验

2.3 番鸭IL-6基因片段的克隆

3 试验结果与分析

3.1 番鸭IL-6基因片段测序结果

3.2 RACE试验结果

3.3 番鸭IL-6克隆结果

4 讨论

4.1 RACE试验

4.2 番鸭IL-6基因片段的克隆

4.3 研究展望

第三部分 结论

参考文献

致谢