5-azacytidine诱导黄曲霉突变株的筛选及鉴定

摘要

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AF）是黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等产毒菌种产生的一类次生代谢产物，是目前发现的毒性和致癌性最强的天然污染物之一。本研究通过 DNA甲基化抑制剂5-azacytidine诱导黄曲霉标准菌株133，获得了一株可以稳定遗传而且不产毒的黄曲霉突变菌株NT，通过ITS序列鉴定发现NT与野生型菌株的ITS序列完全匹配。
　　通过对突变菌株的生长特性分析发现，5-azacytidine诱导得到的黄曲霉突变菌株，较野生型菌株具有较快的生长速率，菌落呈白色；突变菌的菌丝尖端长度为331.9±131.2μm，而野生型菌为141.7±31.7μm；突变菌菌丝隔膜变长，其中突变菌的隔膜长度为66.7±19.9μm，野生型黄曲霉则为49.1±14.1μm；产孢延迟且产孢量急剧下降，在形态上有较大的差异。
　　采用薄层析法(TLC)对黄曲霉突变菌株的代谢产物合成情况进行分析，结果发现突变菌株在培养基中并没有检测到产毒素，但在其菌内却可以检测到少量的AFB2，可能是5-azacytidine诱导后除了AF合成变少外，AF分泌到孢外可能受到了抑制。为了进一步了解突变菌产毒及其形态是如何建成的，本研究通过荧光定量 PCR检测黄曲霉突变菌株中和产毒相关和产孢相关的基因的表达情况，突变体中的产毒结构基因aflD在96 h时下降了79.51倍，产毒调控基因aflR下调了4.55倍；而突变菌中产孢特异基因abaA和brlA在96 h的时候，分别比野生型下调了48.26倍和66.99倍，mRNA表达水平检测结果与产毒和产孢检测情况一致。
　　为了进一步研究产毒受抑制的机理，本研究对突变菌株的氧化应激水平进行了研究，结果表明，黄曲霉突变菌对过氧化氢相对比较敏感，在H2O2浓度为10μmol/L时，5-azacytidine诱变的突变菌的生长就受到了抑制；而菌内的脂质体氧化水平和谷胱甘肽含量检测实验表明，突变菌内的氧化水平比野生型菌株相对较低，可能是由于突变菌体内的氧化应激系统遭到了破坏。本研究旨在从一个全新的角度认识黄曲霉的产毒机理，探究5-azacytidine对黄曲霉的生理影响，进一步揭示丝状真菌次生代谢产物的调控及形态的建成。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写词表

1 文献综述

1.1 黄曲霉毒素的危害

1.2 黄曲霉毒素合成代谢研究

1.4 黄曲霉毒素合成抑制剂研究现状

1.4 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 5-azacytidine诱导黄曲霉突变株的筛选

3.2 黄曲霉突变菌株产毒情况

3.3 黄曲霉菌突变株的鉴定

3.4 黄曲霉突变菌株生长特性研究

3.5 黄曲霉突变菌株代谢产物合成分析

3.6 Real-time PCR检测黄曲霉突变菌中产毒产孢相关基因的表达情况

3.7 黄曲霉突变菌中氧化压力的研究

4 讨 论

4.1薄层色谱（TLC）检测黄曲霉产毒情况的结果探讨

4.2 5-azacytidine诱导黄曲霉突变菌不产毒的探讨

4.3 BrlA和abaA对黄曲霉分生孢子合成的调控

4.4氧化应激和真菌毒素合成的关联

5结论

参考文献

致谢

附录1