多花水仙花色相关基因的克隆与cDNA文库的构建

摘要

多花水仙(Narcissus tazetta L.)栽培品种稀少、花色单一、大多数栽培品种为三倍体而不能进行有性繁殖，这些问题限制了多花水仙在国内外市场的发展。本研究以‘金盏银台’、‘黄花水仙2号’、‘白花水仙1号’为材料，运用RT-PCR与RACE技术克隆了类黄酮生物合成途径中的类黄酮3’-羟化酶(F3’H)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和黄酮醇合成酶(FLS)，并通过荧光定量PCR技术分析了这三个基因在不同花色类型的不同发育阶段花被和副冠中的表达水平；采用SMART技术构建了一个‘黄花水仙2号’盛开期花朵的cDNA文库，并对文库质量进行了鉴定。本研究为利用基因工程培育花色多样的优良水仙品种提供理论和技术支持。
　　1、多花水仙F3’H基因的克隆
　　利用RT-PCR和RACE技术从黄花水仙2号花朵中克隆到F3’H基因的cDNA全长核苷酸序列。全长为1725bp，开放阅读框为1587bp，共编码528个氨基酸，5’非编码区长度为51bp，3’非编码区长度为84bp。根据黄花水仙2号F3’H ORF序列设计一对引物，通过 RT-PCR技术获得金盏银台 F3’H的 ORF序列为1590bp，编码529个氨基酸，与黄花水仙F3’H相比，在529位多了一个色氨酸（W）。两种花色类型水仙 F3’H基因相比较，存在多处碱基的差异，其氨基酸序列比对仍存在多处差异。不同植物氨基酸序列比对结果表明，黄花水仙2号的F3’H与金盏银台、洋葱、百合、山茶花、油点草、金鱼草的F3’H同源性分别为94.52%、71%、67%、63%、65%、61%，且多花水仙F3’H氨基酸序列具有大多数植物共有的多个高度保守区。将获得的两条F3’H基因分别命名为NtF3’HJ(金盏银台)和NtF3’HY（黄花水仙），登录号分别为KC488159和JX292106。
　　2、多花水仙DFR基因的克隆
　　用RT-PCR与RACE技术从黄花水仙2号花朵中克隆到DFR基因的cDNA全长核苷酸序列。DFR基因全长为1286bp，其开放阅读框为993bp，共编码330个氨基酸，5’非编码区长度为63bp，3’非编码区长度为230bp。根据黄花水仙2号F3’H ORF序列设计一对引物，通过RT-PCR技术获得金盏银台和白花水仙1号DFR的ORF序列，均为993bp，共编码330个氨基酸。三种花色类型多花水仙DFR基因核苷酸序列比对结果显示多处碱基的差异，其氨基酸序列比对仍存在多处差异。不同植物氨基酸序列比对结果表明，黄花水仙2号的DFR与金盏银台、白花水仙1号、红掌、野茶树、山茶花、蓝莓、山葡萄的DFR同源性分别为99%、97%、73%、68%、67%、67%、67%，且多花水仙三条DFR氨基酸序列在其 N端都存在由21个氨基酸组成的一个高度保守的 NADP结合区域“VTGAAGFIGSWLVMRLLEQGY”，中部还存在一个底物特异性结合区域“TVCIPGYCQQSVYDENSWTDVEVCRAD”。三条DFR蛋白都不含有信号肽，具有酶典型的三级结构。将得到的三种花色类型多花水仙DFR基因分别命名为NtDFRY（黄花水仙）、NtDFRJ(金盏银台)和 NtDFRB（白花水仙），登录号分别为JX310696、JX310698和JX310697。
　　3、多花水仙FLS基因的克隆
　　利用RT-PCR和RACE技术从金盏银台花朵中克隆到FLS基因的cDNA全长核苷酸序列。全长为1299bp，其开放阅读框为1002bp，共编码333个氨基酸，5’非编码区长度为46bp，3’非编码区长度为251bp。根据金盏银台FLS ORF序列设计一对引物，通过RT-PCR技术获得黄花水仙2号和白花水仙1号FLS的ORF序列，均为1002bp，均编码333个氨基酸。三种花色类型多花水仙FLS基因核苷酸序列比对结果显示多处碱基的差异，其氨基酸序列比对仍存较大差异。不同植物氨基酸序列比对结果表明，金盏银台的 FLS与黄花水仙2号、白花水仙1号、洋葱、三花龙胆、酿酒葡萄、金花茶、野茶树的同源性分别为99%、93%、77%、71%、69%、68%、67%，且多花水仙三个品种的FLS蛋白具有8个非常保守的氨基酸残基：Gly68、His75、Pro215、His229、Asp231、Gly259、His275、Arg286，分布于3个高度保守的氨基酸区域:GIFQIVNHG;NYYPPCPRPDLALG VVAHXDMS; GDQXEILSNGKYKSVLHRTTVNKEKKARMSXPVFCSPX。将得到的三种花色类型多花水仙FLS基因分别命名为NtFLSY（黄花水仙）、NtFLSJ(金盏银台)和NtFLSW（白花水仙），登录号分别为JX467721、JX467719和JX467720。
　　4、荧光定量PCR分析多花水仙花发育不同时期F3’H、DFR和FLS基因的表达
　　以多花水仙Actin基因为内参基因，利用荧光定量PCR技术检测不同花色类型F3’H、DFR和FLS基因在花蕾期、始花期、盛花期、衰败期花瓣及副冠中的表达水平。结果显示 F3’H和 DFR基因的表达趋势比较一致，随着花的开放表达量逐渐增加，到衰败期急剧增加出现峰值；而 FLS基因在金盏银台和白花水仙中的表达量则随着花的开放逐渐减弱，除黄花水仙外，峰值均出现在花蕾期；在黄花水仙中则一直保持着较高的表达水平。
　　5、黄花水仙2号花朵cDNA文库的构建
　　采用SMART技术，以多花水仙‘黄花水仙2号’盛开期花朵为材料，构建了其全长 cDNA文库，并对文库质量进行了鉴定。结果表明，所构建初始文库滴度为6.3×105 cfu/mL，扩增后文库的滴度为1.58×108 cfu/mL，重组率为84%，插入片段大小集中在500-2000bp之间，平均长度约970bp，符合cDNA文库的质量标准，说明所构建的文库比较完整，能够反映黄花水仙在开花过程中基因的表达情况。为进一步研究黄花水仙花色形成机制奠定了很好的基础。

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第一章 综述

1 植物花色的形成机理

2 类黄酮生物合成途径的相关酶基因的研究进展

3 全长cDNA文库的构建方法及应用

4 多花水仙花色的研究进展

5 本研究的内容和意义

第二章 多花水仙类黄酮3’-羟化酶基因cDNA全长的克隆与分析

1 试验材料

2 试验方法

3 结果和分析

4 讨论

第三章 多花水仙二氢黄酮醇4-还原酶基因cDNA全长的克隆与分析

1 试验材料

2 试验方法

3 结果和分析

4 讨论

第四章 多花水仙黄酮醇合成酶基因的克隆及分析

1 实验材料

2 试验方法

3 结果和分析

4 讨论

第五章 多花水仙花色形成过程中F3’H、DFR和FLS基因的荧光定量PCR分析

1 试验材料

2 试验方法

3 结果和分析

4 讨论

第六章 黄花水仙cDNA文库的构建

1 试验材料

2 试验方法

3 结果和分析

4 讨论

参考文献

附录Ⅰ 多花水仙三种花色的不同发育时期

附录Ⅱ 多花水仙F3’H cDNA核苷酸比对结果

附录Ⅲ 多花水仙F3’H cDNA编码产物的氨基酸组成

附录Ⅳ 多花水仙DFR cDNA核苷酸比对结果

附录Ⅴ 多花水仙DFR cDNA编码产物的氨基酸组成

附录Ⅵ 多花水仙FLS cDNA核苷酸比对结果

附录Ⅶ 多花水仙FLS cDNA编码产物的氨基酸组成

附录Ⅷ 金盏银台FLS与中国水仙FLS及洋水仙ANS cDNA核苷酸比对

致谢