甘蔗斑茅杂交后代育性相关基因的克隆与表达分析

摘要

甘蔗（Saccharum L.）不仅是世界上最重要的糖料作物，还是重要的能源作物之一。斑茅作为一种优良的种质资源，在甘蔗品种选育中具有重要利用价值。斑茅与甘蔗杂交后代常表现育性低或不育，这对甘蔗杂交育种产生了消极影响。但杂交后代间育性有分离，因而对育性差异基因进行深入研究是很有必要。育性相关基因研究为解释这种现象提供理论依据和基因储备。本研究基于邓祖湖等以花粉育性有差异的斑茅杂种BC1及其亲本为材料进行的基因芯片杂交结果，并结合相关文献，克隆了几个芯片中稳定表达的差异基因，并对其表达进行了初步分析。主要结果和结论如下：
　　1.基于芯片，课题组前期克隆了ScMADS1基因，通过同源比对发现该基因与水稻SVP基因相似性达83%，qRT-PCR结果表明该基因与水稻SVP的表达模式一致，在营养组织和花穗中都有表达；而且，ScMADS1在三套育性差异材料中均呈现在可育材料中高表达；这暗示ScMADS1可能在甘蔗育性方面起作用。为了探索ScMADS1与其他MADS-box基因的调控关系，克隆了甘蔗 MADS-box各功能家族的代表基因cDNA片段——ScLHS,ScAP1, ScAG2, ScPI。然后以育性有差异的、不同发育时期的甘蔗花穗为材料通过qRT-PCR分析相对表达量，并结合拟南芥中基因调控网络模型，推测了甘蔗中ScAP1、ScAG2、ScPI、ScLHS和 ScMADS1之间的网络调控关系。本实验还构建了pCAMBIA-MADS1过量表达载体，为该基因功能的验证奠定了基础。
　　2.根据芯片和相关文献，发现SR基因，作为一种重要剪接因子，在花的发育以及植物生长发育中具有重要的作用。实验克隆了3个丝氨酸精氨酸丰富蛋白（SR）基因——ScSCL25,ScSCL30和ScRS31。ScSCL25 cDNA序列全长为963bp，编码209个氨基酸；gDNA序列全长为2966bp，包括五个内含子。ScSCL30的cDNA序列全长为867bp，编码264个氨基酸，可能有6个大的内含子。序列分析表明这两个基因同属于SC35-like亚家族，均编码不稳定的亲水蛋白。将ScSCL30基因与高粱的gDNA比对发现其共线性在5′端中断，推测在此处可能产生了一个倒位。ScRS31属于 RS亚家族，cDNA序列长1120bp，具有 polyA结构，编码蛋白包含两个RNA结合结构域（RRM）。基因结构预测显示该基因gDNA序列长约5000bp，包含15个大的内含子。
　　实时荧光定量实验表明 ScRS31在甘蔗芽、花和根中特异性表达，推测该基因参与花和根的发育。与 ScRS31相似，ScSCL30也在花、第一节间和芽中表达量比较高。两种 SR蛋白均在花中有较高的表达量，暗示两者可能存在互作，且在花的发育中起作用。此外，实验还发现ScSCL30与ScRS31表达量与甘蔗材料的育性没有呈现一定的规律。
　　3.根据基因芯片，还克隆了一个茉莉酸激素诱导蛋白基因ScJIP32，氨基酸序列比对发现该基因与木菠萝素家族凝集素(Jacalin-related lectin)同源性很高，包含两个功能区：一个疾病响应结构域（dirigent domain）和一个木菠萝素家族凝集素相关凝集素结构域（jacalin domain）。研究发现 ScJIP32受茉莉酸诱导后表达量迅速下降；盐胁迫处理也能使该基因表达量下降，而且原核盐胁迫实验再次证明了该基因在盐胁迫中起到积极的作用。ScJIP32基因在第一节间表达量最高，其次是根、芽和花穗，在叶片和其他节间基本不表达。而在不同育性材料中，该基因的表达量与育性没有呈现一致性的规律。
　　构建了pET-JIP32原核表达载体，经IPTG诱导在大肠杆菌中表达出融合蛋白，并用Ni柱纯化出目的蛋白，为该基因的功能研究奠定了基础。此外，还构建了真核表达载体pCAMBIA-JIP32，为转基因验证该基因功能提供了基础。
　　简单概括，筛选到ScMADS1基因为育性关键基因，该类基因在花的发育中发挥着重要作用。而调控因子SR类基因在甘蔗的生长点表达量高，可能参与细胞分裂，与植株的生长发育有关。茉莉酸诱导蛋白基因ScJIP32，受到茉莉酸和盐胁迫负控诱导，在盐胁迫中发挥一定作用；在第一节间生长点表达量最高，推测其表达可能也与细胞分裂和生长有关。

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第一章 综述

1甘蔗花、穗的结构和发育过程

2花的发育模型

3植物雄性不育研究进展

4甘蔗育性相关基因筛选

5本课题研究目的与意义

第二章甘蔗MADS-box基因cDNA片段克隆与表达分析

1材料与方法

2 结果与分析

3讨论与小结

第三章 丝氨酸精氨酸丰富蛋白的克隆与分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论与小结

第四章 茉莉酸诱导蛋白ScJIP32的克隆与表达分析

1材料与方法

2结果与结论

3讨论与小结

总结

参考文献

附录

致谢