番鸭性别控制及其性腺分化时期的研究

摘要

本试验以莆田广东温氏家禽有限公司提供的番鸭（Cairina moschata）为实验对象，通过人工受精的方式研究在精液稀释剂中添加不同浓度的芳香化酶抑制剂进行性别控制的可行性，并观察芳香化酶抑制剂对受精率、孵化率等生产指标的影响。
　　利用H.E、PAS、免疫组化3种方法，对原始生殖细胞、卵原细胞及支持细胞进行定位，在细胞水平观察番鸭性腺分化的具体时期。
　　根据GenBank中近源物种的AMH、ER-α基因的序列，在两个基因的保守区设计并合成特异性引物，以鸭甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，建立SYBR Green I实时荧光定量 PCR（RT-FQPCR）方法在分子水平对性腺分化时期进行研究。
　　主要结果：
　　1、在孵化第7天照蛋检测受精情况，处理3的受精率极显著的高于处理1空白对照组（P＜0.01），处理4显著高于处理1(P<0.05)，处理2、5、6都略高于处理1但是差异不显著（P>0.05）；在受精蛋孵化率方面，各组之间均无显著性差异（P>0.05），其中处理2、6略低于处理1，处理3、4、5略高于处理1；通过翻肛鉴定生殖性别和DNA基因组检测遗传性别后，发现处理2、3、4、6出现不同程度的性反转，处理2、处理3、处理4性反转个体间无显著性差异（P>0.05），与处理1对照组相比，差异显著（P<0.05）；处理6性反转个体极显著高于处理1对照组（P<0.01）。
　　2、通过对番鸭胚胎进行组织切片发现：4d的胚胎肾管开始形成；5d的胚胎在体腔角增厚区出现原始生殖细胞(Primordialgermcell，PGC），PGC细胞核大且圆，核膜清晰、界限明显，明显大于其他体细胞；6d胚胎的生殖脊开始建立，大量PGCs聚集于此，通过PAS染色呈鲜红色，很容易定位；7-8d性腺纵向发育，开始膨大，并与中肾开始分离，PAS染色变浅，糖原开始分化；9d雌性胚胎已初现卵巢特征，性腺明显地分为两层，外层含有PGCs大小的生殖细胞，内层含有血管；10d雄性胚胎也出现了睾丸的特征，性腺中已有曲精细管的雏形，在曲精细管边上可以观察到支持细胞。
　　通过Mvh标记原始生殖细胞及卵原细胞和GDNF标记支持细胞结果显示：Mvh阳性细胞6d-8d雄性和雌性番鸭胚胎中阳性细胞数量没有显著差异（P>0.05)，9d-10d雌性胚胎中阳性细胞数量极显著高于雄性胚胎（P<0.01）。雄性胚胎中Mvh阳性细胞在9d-10d增殖速度与6d-9d相比显著降低（P<0.05），阳性细胞数量甚至有减少的趋势。
　　GDNF阳性细胞在雌性胚胎均未出现GDNF的阳性细胞。雄性胚胎6-8d也未出现GDNF的阳性细胞，9d-10d，GDNF阳性细胞开始逐渐出现，并有增长的趋势。
　　3、建立AMH和ER-α基因的标准曲线，模板的浓度梯度（copies）与Ct（Cycle）之间有较好的线性关系。各基因的斜率（R2）均大于0.995；各基因的的扩增效率（E）均接近1，且各目的基因与内参基因间的差异均小于5%，均符合要求；说明各基因可以进行下一步RT-FQPCR分析。
　　AMH基因在6-10胚龄的雄性胚胎性腺中的表达量均高于雌性胚胎。AMH基因在6胚龄、7胚龄两性性腺中表达量差异不显著（P>0.05）；8-10胚龄，雄性胚胎性腺的AMH表达量均极显著的高于雌性胚胎性腺（P<0.01）；AMH在雄性胚胎性腺中的表达量呈逐渐升高的趋势；在雌性胚胎中各胚龄之间表达量差异不显著（P>0.05）。
　　ER-α基因在每个胚龄的雌性番鸭胚胎性腺中的表达量均极显著地高于雄性胚胎性腺（P<0.01），且随着胚胎的发育表达量呈上升趋势。在雄性胚胎中，6-8胚龄 ER-α的表达差异呈显著性增长（P<0.05）；9胚龄则极显著的高于8胚龄的表达量（P<0.01）但与10胚龄差异不显著（P>0.05）。在雌性胚胎中，6-7胚龄性腺中 ER-α基因表达差异不显著（P>0.05）；8-10胚龄均呈极显著增长（P<0.01）。
　　4、通过细胞水平观察，我们发现9-10d胚胎形成卵巢和睾丸的细胞雏形，免疫组化结果显示，公母胚胎阳性细胞分别在8天和9天开始发生明显变化；基因水平的实验结果显示，AMH和ER-α基因的表达在8-9天胚胎中出现显著或者极显著地增长。由于基因表达早于细胞形态的变化，因此，我们认为番鸭胚胎的性腺分化时期在8-9天。

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文献综述

1.引言

2.禽类的性别

3.性别控制的研究进展

4.胚胎性腺的分化及性别决定基因

5.实时荧光定量 PCR（Real-time Fluorecent Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-FQPCR)

6.研究的目的与意义

试验部分

试验一 芳香化酶抑制剂对番鸭性别控制的研究

1.序言

2.材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

试验二番鸭性腺分化的组织学研究

1.序言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

试验三 番鸭胚胎AMH和ER-α基因的表达研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3.讨论

全文总结

参考文献

致谢