梨资源ISSR分析与花芽休眠解除研究

摘要

梨属蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科(Maloideae)梨属（Pyrus L）落叶树种，我国已有三千多年栽培历史。梨花作为我国的传统名花，不仅形态美丽，香味淡雅而且也具有深厚的文化积淀，具有极高的观赏价值。然而梨花花芽萌动之前需要经过一定时间的低温休眠，休眠解除后花芽方可萌动。南方低需冷量早熟砂梨具有开花早，成熟早的特点，可以占领北方市场的空档，具有巨大的经济效益。因此，进行梨花资源分析和梨花芽休眠解除的研究就显得尤为重要。
　　本研究从两个方面进行展开，一方面建立了适合南亚热带地区梨种质资源的ISSR-PCR反应体系，得出38份梨品种遗传聚类与低温需冷量之间的关系；另一方面以福建主栽的中需冷量品种黄花梨（Pyrus pyrifolia var. huanghua）休眠解除不同时期的花芽为材料，通过石蜡切片进行镜鉴，确定取材的准确性和代表性。完成梨花芽休眠解除相关基因的差减文库构建。通过测序得出相关差异基因，并通过NCBI-BLAST对EST数据进行同源性分析，运用Blast2 go，WEGO等在线软件对测序结果进行GO注释和归类分析。找出了相关可能参与调节花芽休眠解除的基因，为梨花芽休眠解除奠定一定理论基础。具体研究结果如下：
　　1.针对梨叶片多糖多酚，单宁类物质较多的特点，优化了梨叶片基因组DNA的提取方法。建立了适合南亚热带地区梨品种的ISSR-PCR反应体系，即20μL反应体系为体系中10×PCR buffer（不含Mg2+）2μL，模板DNA浓度60 ng, TaqDNA聚合酶0.75 U，引物浓度1μmol/L，dNTP浓度90μmol/L，Mg2+浓度为2.25 mmol/L。对38份梨品种的遗传关系进行聚类分析，以得出这38份梨品种的聚类结果与低温需冷量之间的相互关系。实验从96条ISSR引物中筛选出19条特异性较好的引物，共扩增出111条带，其中特异性条带86条，占77.5%。遗传相似性系数在0.69~0.97之间，将供试品种分为西洋梨和东方梨两个大品系。东方梨又分为豆梨，砂梨和以棕包梨为首的三个聚类，在大部分砂梨的聚类分析中，其多样性与低温需冷量基本相关，从而为南亚热带地区梨品种花芽休眠解除所需的低温需冷量研究提供一定参考依据。
　　2.对黄花梨花芽休眠解除不同时期进行采样，运用石蜡切片技术对其进行形态解剖观察，以确定所采集样品为处于休眠期间和休眠解除后的对应时期。实验以休眠解除后的花芽为检测子“Tester”，处于休眠期间的花芽为驱动子“Driver”，构建梨花芽休眠解除相关基因的正向差减文库(PZ)；以处于休眠期间的花芽为检测子“Tester”，休眠解除后的花芽为驱动子“Driver”，构建梨花芽休眠解除相关基因的反向差减文库(PF)。在1500μL的转化产物中，取10μL菌液涂板，正向文库共长出378个菌落，其中蓝斑41个，重组率为89%，可得出28350个菌落/μL连接产物；反向文库共长出326个菌落，其中蓝斑31个，重组率为90%，24450个菌落/μL连接产物。菌落PCR验证显示正、反向差减文库（PZ,PF）插入片段大小均集中分布在500 bp-2000 bp之间，平均插入片段大小约为750 bp。随机挑选正、反向差减文库（PZ,PF）各150个单克隆，正向文库成功测序123个，占82%；反向文库成功测序127个，占84.6%。通过NCBI-BLAST的同源性比对，得出可能与花芽休眠相关 IAA、MYB1、BZIP、WRKY转录因子，脱水素，蛋白激酶，结构蛋白，AP2域类转录因子，NADH脱氢酶，钙结合蛋白，其中大部分为全长序列。将正、反向差减文库（PZ,PF）的测序结果运用Blast2 go进行GO注释，再用WEGO进行功能分类。将基因所编码蛋白分为细胞组成(Cellular Componen)，分子功能（Molecular Function)和生物进程（Biological Process)三类。本研究综合了SMART技术，单链杂交技术，DSN技术，巢式PCR技术等，建立了能稳定得出梨花芽休眠解除相关的全长差异基因的单链差减杂交文库。为梨花芽休眠解除相关基因调控提供一定理论基础。

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第一章 前言

1. 本研究的意义

2. ISSR分子标记的研究进展

3. 蔷薇科植物花芽休眠解除的需冷量研究进展

4. 本研究的技术路线

第二章 38份梨花品种基于ISSR聚类结果的需冷量特性分析

1 实验材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 梨花芽休眠解除差减文库的构建

1 材料

2 实验方法

3 结果与分析

4 讨论

参考文献

附录:

致谢