尤溪金柑等柑橘类种质离体保存及其Fc-MLP2基因克隆与表达

摘要

本试验以尤溪金柑（金弹Fortunella crassifolia cv. Youxijingan）等柑橘类植物试管苗为材料，进行了尤溪金柑再生体系建立与优化、柑橘类植物种质资源保存、尤溪金柑Fc-MLP2基因的克隆表达、Fc-MLP2基因转化烟草及Fc-MLP2基因功能的初步鉴定等研究。主要结果如下：
　　1、尤溪金柑再生体系建立及优化
　　本试验优化筛选出了适合尤溪金柑试管苗增殖和生根的培养基。结果表明：KT对芽的增殖有促进作用；NAA和KT共同作用下，处理G2（MS+NAA0.05 mg/L+KT1.5 mg/L）的芽增殖系数显著高于其它处理；NAA和BA共同作用下，影响芽增殖的主次因素为BA>BA*NAA>NAA，芽增殖的最优培养基为：MS+6-BA1.2 mg/L+NAA0.05 mg/L，增殖系数最高，达到了10.60；影响生根的主次因素为NAA>IBA>NAA*IBA，生根最优培养基为：MS+NAA0.3 mg/L+IBA0.2 mg/L，生根率最高达到了83.33%，生根数均值达到了3.27个。
　　2、尤溪金柑等柑橘类植物种质资源保存
　　本试验以尤溪金柑为材料，研究了培养容器、培养基中的 CaCl2、甘露醇和 PP333等因素对柑橘种质资源缓慢生长保存的影响。结果表明：当CaCl2的浓度为0.22 g/L时，尤溪金柑试管苗的根冠比最大，比较适合柑橘种质资源缓慢生长保存；在 CaCl2、甘露醇和 PP333共同作用下，分别在保存6个月和12个月时统计试管苗成活率，结果表明：保存6个月和12个月时处理C4（MS+CaCl20.44 g/L+甘露醇0 g/L+PP3331 mg/L）中尤溪金柑试管苗的存活率均为最高，分别达到了100%和97.8%。
　　本试验在原有保存3年的67份柑橘种质资源的基础上新收集了25份柑橘种质资源，并对所收集种质资源试管苗的生长状态进行观察记录。结果显示：柚类种质资源试管苗生长比较健壮，根系发达，叶片大而浓绿，但徒长严重，叶片较为稀疏；野生柑橘类试管苗长势普遍较弱，根系和茎杆都较弱，转接继代时还发现，该类试管苗生根能力也很弱；金柑类和宽皮柑橘类试管苗的长势介于柚类和野生柑橘试管苗之间。
　　3、 Fc-MLP2基因的克隆与生物信息学分析
　　本试验采用RT-PCR结合RACE技术，第一次以尤溪金柑试管苗为材料，克隆得到尤溪金柑Fc-MLP2基因的全长cDNA序列，其在GenBank中的登录号为JX310276。Fc-MLP2基因全长908 bp，含有一个669 bp的开放阅读框，编码223个氨基酸。生物信息学分析表明：该蛋白是定位于细胞外的一种疏水性分泌蛋白，具有2个功能位点、13个磷酸化位点和信号肽，其二级结构由α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲组成。系统进化树分析表明：尤溪金柑 Fc-MLP2蛋白与粗皮柠檬 RlemMLP2蛋白亲缘关系较近，聚为同一类。推测Fc-MLP2蛋白可能在植物抗虫、抗病原菌、抗饥饿和延缓植物衰老方面起到一定作用。
　　4、尤溪金柑种质资源保存过程中Fc-MLP2基因的定量表达
　　采用 qRT-PCR技术，以18S rRNA基因为内参基因，对尤溪金柑试管苗不同保存阶段Fc-MLP2基因的 mRNA转录表达进行研究，结果表明：Fc-MLP2基因在尤溪金柑保存过程中各时期都有表达，保存4个月时相对表达量最高；保存0个月和12个月时Fc-MLP2基因表达量很低，12个月时达到最低；保存8个月时Fc-MLP2基因的表达量与保存6个月时又有所增加，之后随着时间的延长Fc-MLP2基因相对表达量逐渐减少；尤溪金柑保存过程中 Fc-MLP2基因的相对表达量与保存过程中尤溪金柑的生长状态密切相关，当尤溪金柑的生长活动较活跃、保存过程中有新叶发出时，Fc-MLP2基因的相对表达量较高。
　　5、尤溪金柑Fc-MLP2转化烟草与功能验证
　　本试验通过XbaⅠ和SalⅠ双酶切技术构建pCAMBIA1301-Fc-MLP2表达载体，并转化到农杆菌EHA105中。农杆菌介导法将Fc-MLP2基因导入烟草，潮霉素抗性筛选后对抗性植株进行PCR检测和GUS检测。结果显示：目的基因片段已成功转入到烟草中，转化率为62.22%。低温（4℃）和机械损伤处理转基因烟草，分别在处理后的0、3、6、12、24、48 h时取样进行qRT-PCR扩增，检测不同时间段Fc-MLP2基因的表达量变化。结果显示；低温处理后转基因烟草中 Fc-MLP2基因相对表达量均显著减少；转基因烟草在受到机械伤害12 h后，Fc-MLP2基因相对表达量显著增加。可以推测，Fc-MLP2基因可起到抵御逆境的作用。

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第一章 引言

1 植物种质资源离体保存研究进展

2 柑橘类植物种质资源离体保存研究进展

3 植物MLP2基因的研究进展

4 植物基因转化烟草的研究

5本研究的目的意义和主要研究内容

第二章 尤溪金柑再生体系的建立与优化

1试验材料和方法

2 结果分析

3讨论

第三章 尤溪金柑等柑橘类植物种质资源的离体保存研究

第一节 尤溪金柑种质资源离体保存条件的探讨与优化

第二节92份柑橘种质资源试管苗离体保存与生长状态观察

第四章 尤溪金柑试管苗Fc-MLP2基因的克隆及其生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 Fc-MLP2基因的荧光定量PCR分析

1材料和方法

2 结果分析

3 讨论

第六章Fc-MLP2基因转化烟草与功能鉴定研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第七章 小结

1 尤溪金柑再生体系建立及优化

2 尤溪金柑等柑橘类植物种质资源保存

3 Fc-MLP2基因的克隆与生物信息学分析

4 尤溪金柑种质资源保存过程中Fc-MLP2基因的定量表达

5 Fc-MLP2基因转化烟草的研究

参考文献

附录Ⅰ图版及图版说明

附录2 尤溪金柑Fc-MLP2基因序列登录GenBank信息

附录3 攻读硕士期间发表论文与参加学术会议情况

致谢