番鸭IGF-I基因的全长cDNA克隆、表达及与产蛋性能的关联分析

摘要

为研究番鸭的就巢机理，本试验选用番鸭为试验样本，选择番鸭胰岛素样生长因子1（Insulin like growth factor-1，IGF-1)基因为研究对象，通过逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术和cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得番鸭IGF-1基因cDNA全序列；应用多种生物信息学软件对获得的番鸭IGF-1基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行分析，并通过同源建模对翻译的蛋白质的三维结构进行预测；根据克隆所得的番鸭IGF-1基因cDNA的全长序列，针对其保守区设计特异性引物，并以鸭肌动蛋白（β-Actin）基因（EF667345.1）为内参基因，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR（RT-FQPCR）方法对IGF-1基因在非就巢期与就巢期的番鸭不同组织的差异性表达进行研究；利用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）方法检测番鸭IGF-1基因的多态性，并分析其多态性与番鸭产蛋性能的关联。
　　结果如下：
　　1.从番鸭肝脏中首次成功得到IGF-1基因的cDNA序列全长960bp，编码区（CDS）为462bp，编码153个氨基酸；序列比对和同源性分析显示，在核苷酸水平，该基因与灰雁（Anser)的相似度最高，为99％，与原鸡（Gallus gallus）和火鸡（Meleagris gallopavo）的同源性为98%；在氨基酸水平，与灰雁的同源性达99%；蛋白结构分析结果表明IGF-1含有1个Insulin/IGF/Relaxin family结构域，具有1个跨膜结构，使用PredictProtein在线工具进行二级结构预测发现蛋白有30.07%helix，0.65%strand，69.28%loop，同源建模得到该蛋白的三维结构。
　　2. IGF-1基因在番鸭肝脏中的表达最高，依次为心脏、垂体、下丘脑、卵巢、脾脏、肾脏、肺脏、胰脏、腺胃、十二指肠，在肌胃中的表达量最低。在非就巢的番鸭群体中， IGF-1基因在下丘脑、垂体、卵巢的表达高于就巢期的番鸭群体，差异极显著（P＜0.01）；在肝脏、心脏的表达显著（P＜0.05）高于就巢期的番鸭群体。在肾脏、肺脏、肌胃、腺胃、胰脏和十二指肠中，IGF-1基因的表达量无显著差异（P＞0.05）。
　　3.通过测序在番鸭IGF-1基因的5’端调控序列检测到1个位点的碱基突变A/G；检测出AA、GG、和AG三种基因型，不同基因型与番鸭的开产日龄和300日龄产蛋数显著相关（P＜0.05），与番鸭最长连产天数和平均连产天数无显著相关（P＞0.05）。

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第一章文献综述

1 背景

1.1家禽就巢行为的研究进展

2 IGF-I与IGF-I基因的研究

2.1 IGF-I的发现

2.2 IGF-I结构及功能

3 cDNA末端快速克隆技术（RACE）

3.1 RACE技术原理

3.2 RACE的应用及前景展望

4 实时荧光定量PCR技术

4.1 RT-FQPCR原理

4.2 RT-FQPCR应用

5 SNP和PCR-SSCP

6 本研究的目的、意义及创新点

第二章番鸭IGF-I基因全长cDNA的克隆和生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 试验动物

1.2 主要试剂和仪器

1.3 引物设计与合成

1.4 试验方法

2 结果与分析

2.1 肝脏Total RNA的检测结果

2.2 番鸭IGF-I基因部分cDNA序列获得结果

2.3 IGF-I基因全长cDNA序列结果

2.4 RACE序列验证

2.5 IGF-I基因序列同源性分析

2.6 编码蛋白的基本理化性质分析

2.7 编码蛋白结构分析

3 讨论

第三章番鸭就巢期和非就巢期IGF-I基因的差异表达研究

1 材料与方法

1.1 试验动物和器官组织选择

1.2 主要试剂和仪器

1.3 引物设计及合成

1.4 总RNA的提取与反转录

1.5 RT-FQPCR反应条件的优化

1.6 RT-FQPCR扩增

1.7 数据处理和分析

2 结果与分析

2.1番鸭各组织总RNA检测

2.2 各基因引物可用性检测结果

2.3 各基因的标准曲线

2.4 RT-FQPCR熔解曲线和扩增曲线

2.5 IGF-I基因在番鸭就巢期与非就巢期的组织表达差异

3 讨论

第四章 番鸭IGF-I基因多态性及其与产蛋性状的关联分析

1 材料

1.1 试验对象

1.2主要仪器与试剂

2 方法

2.1 番鸭基因组DNA的提取

2.2 番鸭基因组DNA的检测

2.3 IGF-I基因的PCR扩增

2.4 IGF-I基因单链构象多态性检测（PCR-SSCP)

2.5 数据统计及分析

3 结果

3.1 番鸭基因组DNA的检测结果

3.2 番鸭IGF-I基因PCR扩增结果

3.3 番鸭IGF-I基因SNPs检测结果

3.4 番鸭IGF-I基因多态性与番鸭产蛋性能关联分析

4 讨论

4.1 PCR-SSCP注意事项

4.2 IGF-I基因多态性研究

全文结论

参考文献

致谢