三明野生蕉和天宝蕉WHIRLY基因克隆及其定量表达分析

摘要

香蕉是世界重要水果之一，中国香蕉产量居第四位。香蕉作为世界重要水果，种质资源相对缺乏。野生蕉为香蕉提供了很重要的种质资源。野生香蕉为二倍体，可以进行有性繁殖，抗逆性强。福建省分布有大量野生蕉，三明野生蕉分布于三明市山区，抗寒性较强。天宝蕉主要分布于闽南地区，为福建最著名的主栽品种，抗性较弱。WHIRLY（WHY）是转录因子，在植物防御反应中起到有重要的作用。Whirly蛋白家族的成员贯穿于整个植物王国，具有可与单链DNA结合的能力。本实验以三明野生蕉和天宝蕉为材料，克隆WHIRLY基因，并进行在低温、水杨酸和NaCl处理下的qPCR分析。
　　1.香蕉基因组WHIRLY家族基因基因结构及生物信息学分析
　　马来西亚小果野蕉（Musa acuminata,AA group）香蕉全基因组WHIRLY家族基因检索结果获得2个WHIRLY家族基因，只有一个为完整的CDS。一个位于6号染色体上，另一个位于9号染色体上。Why1位于6号染色体共有8个外显子，7个内含子。
　　生物信息学分析表明，香蕉基因组Why1属于不稳定、亲水蛋白；保守结构域分析表明Whirly基因家族包含植物Whirly转录因子；香蕉基因组Why1不具有信号肽，不属于分泌蛋白；香蕉基因组Why1蛋白位于线粒体基质可能性最大；Why1蛋白共有22个磷酸化位点，丝氨酸（Ser）位点有16个，苏氨酸（Thr）位点有5个，酪氨酸（Tyr）位点有1个；Why1蛋白未形成卷曲螺旋；二级结构表明Why1蛋白由主要结构元件为无规则卷曲和β折叠，α螺旋所占比例最小。
　　2.三明野生蕉和天宝蕉WHIRLY基因的克隆及其生物信息学分析
　　以三明野生蕉（Musa spp.,AB group）和天宝蕉（Musa spp.CV.Tianbaojiao,AAA group）叶片为材料提取RNA，利用RT-PCR结合RACE法，从三明野生蕉中分离得到Whirly家族三个成员，Why1有完整的ORF，开放阅读框为755bp，编码245个氨基酸，登录号为KC127691，Why2和Why3只有保守区，登录号分别为KJ957798和KJ957799；从天宝蕉中分离得到Why1具有完整的ORF，开放阅读框为755bp，编码245个氨基酸，登录号为KJ637331。
　　生物信息学分析表明，三明野生蕉Why1属于不稳定、亲水蛋白；保守结构域分析表明Whirly基因家族包含植物Whirly转录因子；该蛋白不具有信号肽，不属于分泌蛋白；该蛋白位于线粒体基质的可能性最大；该蛋白共有25个磷酸化位点，丝氨酸（Ser）位点有19个，苏氨酸（Thr）位点有5个，酪氨酸（Tyr）位点有1个；该蛋白未形成卷曲螺旋；二级结构表明三明野生蕉Why1蛋白由主要结构元件为无规则卷曲和β折叠，α螺旋所占比例最小；该蛋白与单子叶禾本科植物的玉米、高粱的亲缘关系比较近，而与双子叶木本蔷薇科的苹果和碧桃等植物亲缘关系较远。
　　天宝蕉Why1蛋白是一个不稳定蛋白，属于亲水蛋白；保守结构域分析表明Whirly基因家族包含植物Whirly转录因子；天宝蕉Why1蛋白不具有信号肽，亚细胞定位预测结果表明，天宝蕉Why1蛋白位于线粒体和叶绿体的可能性最大。天宝蕉Why1蛋白属于碱性蛋白，其中Ser、Val、Pro所占比重较大。二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。二级结构中无规则卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。
　　3.三明野生蕉和天宝蕉WHIRLY基因的定量表达分析
　　以28℃，20℃，13℃，4℃，0℃下处理36h的三明野生蕉cDNA为模板，Why1在不同温度处理下出现2次表达高峰，分别是20℃和4℃，Why1基因可能参与调控多个抗寒相关基因的转录；不同温度处理下Why2的表达模式与Why1相似，但是表达量相对较低，说明Why1对不同温度的反应更敏感；8℃低温处理下，Why1和Why2的表达模式相似，总体是被诱导的。因此WHIRLY可能参与了抗寒途径的调控。在低温8℃，SA处理下，Why1和Why2的表达模式相似，在4h时表达量低于对照组，其他时间表达量均高于对照组，Why1和Why2总体都是被诱导的；在28℃和8℃SA处理下，三明野生蕉Why1和Why2表达量与温度相关性不大，温度对SA诱导三明野生蕉WHIRLY的表达还需进一步研究。综上所述，三明野生蕉WHIRLY基因可能参与了抗寒抗病、抗衰老、抗寒等相关抗逆途径的调控。
　　天宝蕉Why1在4℃处理下总体来说是被诱导的，但是并不是很显著，推测Why1基因参与了天宝蕉的低温响应，在抗寒相关基因的转录过程中发挥着一定的作用；SA处理，在4h时天宝蕉Why1基因表达量达到峰值，表达量达到18.42倍，处于最高水平，说明SA强烈诱导天宝蕉Why1基因的表达；NaCl处理下，天宝蕉Why1总体被诱导，表明天宝蕉Why1在NaCl处理时表现出较强的响应能力。

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第一章 引言

1 香蕉分子生物学研究进展

2 野生蕉研究进展

3 WHIRLY转录因子研究进展

4 本研究的目的及意义

第二章 香蕉基因组WHIRLY家族基因基因结构和生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果分析

第三章 三明野生蕉和天宝蕉WHIRLY基因克隆

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

1材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 三明野生蕉WHIRLY基因定量表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 天宝蕉WHIRLY基因的定量表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第六章 小结

参考文献

附录 WHIRLY基因（cDNA）序列登录

致谢