燕麦嗜酸菌鞭毛素FliCaaa诱导水稻免疫反应的研究

摘要

作为一种PAMP分子，病原细菌鞭毛素可以引发植物的免疫反应（PTI），如细胞死亡、H2O2产生、活性氧爆发和胼胝质沉积等。在激发植物 PTI时，许多细菌的鞭毛素的不同结构域有不同的诱导效率，N端保守的22个氨基酸（flg22）区段比全长蛋白诱导拟南芥、烟草和番茄等植物更强的免疫反应，表明此区段是免疫反应的诱导活性中心。燕麦嗜酸菌（Acidovorax avenae subsp. avenae，Aaa）水稻不亲和亚种菌株N1141的鞭毛素能引起水稻PTI，然而该蛋白N端保守的flg22却缺乏此诱导功能，推测该鞭毛素诱导水稻PTI的功能域可能位于flg22以外的某个未知区段，有必要进行深入的研究。
　　本研究首先分析了4个Aaa菌株诱导水稻PTI的能力，确定IPN1菌株具有诱导水稻免疫反应的能力。在此基础上，克隆获得到了该菌株2个序列不完全相同的鞭毛素基因fliCaaa和fliC2aaa，两者序列同源性达89.25％，都编码含有492个氨基酸的蛋白，该蛋白具有flagellin-N和flagellin-C两个保守结构域。对鞭毛素基因flicaaa全长、N端和C端进行了原核表达，获得了纯化蛋白FliCaaa及其截短肽段FliCaaa-N和FliCaaa-C。通过浸润接种处理水稻日本晴叶片组织，测定了它们诱导水稻免疫反应的活性。结果发现3种蛋白均能够诱导水稻细胞死亡和H2O2产生；FliCaaa诱导PR10a的表达量大约是FliCaaa-N和FliCaaa-C处理后表达量的4倍，表明FliCaaa引起的免疫反应强于FliCaaa-N和FliCaaa-C。3种蛋白处理过的水稻悬浮细胞产生微弱ROS。此外，进行了鞭毛素基因flic2aaa分段原核表达，得到了纯化的FliC2aaa和FliC2aaa-N蛋白。结果发现FliCaaa蛋白诱导水稻PTI的能力强于FliC2aaa。因此，本研究验证了FliCaaa蛋白对水稻免疫反应的诱导功能，为深入鉴定其活性位点、揭示其作用机理提供了试验依据和材料。

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第一章 引言

1 植物与病原菌的互作

1.1 植物的免疫系统

1.2引起植物免疫反应的PAMPs

2 细菌鞭毛素与植物的互作

2.1 细菌鞭毛的结构组成

2.2植物识别细菌鞭毛素的活性位点

2.3 识别细菌鞭毛素的植物受体

3 鞭毛素诱导的植物防卫反应

3.1 鞭毛素诱导的早期防卫反应

3.2 鞭毛素诱导防卫基因的表达

4 燕麦嗜酸菌鞭毛素诱导的水稻防卫反应

5研究目的和意义

第二章 材料与方法

1实验材料

1.1 供试菌株和植物

1.2 主要仪器和试剂

1.3 培养基和培养条件

2 实验方法

2.1 燕麦嗜酸菌菌株诱导水稻免疫反应的测定

2.2 鞭毛素的基因克隆与生物信息学分析

2.3鞭毛素基因原核表达载体构建和目的蛋白纯化

2.4 鞭毛素蛋白诱导水稻免疫反应的测定

第三章 结果与分析

1 Aaa IPN1诱导水稻免疫反应的分析

1.1 Aaa IPN1引起水稻细胞死亡检测

1.2 Aaa IPN1引起水稻产生H2O2检测

2 Aaa IPN1鞭毛素基因的克隆和生物信息学分析

2.1目的基因fliCaaa和fliC2aaa的获得

2.2 鞭毛素FliCaaa和FliC2aaa生物信息学分析

3 FliCaaa蛋白及其不同结构域诱导水稻免疫反应的功能分析

3.1 目的基因fliCaaa、fliCaaa-N和 fliCaaa-C获得和表达质粒构建

3.2目的蛋白的诱导表达

3.3 FliCaaa、FliCaaa-N和FliCaaa-C蛋白纯化和Western blot 验证

3.4 FliCaaa蛋白及其结构域对水稻叶组织细胞死亡的诱导作用

3.5 FliCaaa蛋白及其结构域对水稻叶组织H2O2产生的诱导作用

3.6 FliCaaa蛋白及其结构域对水稻防卫基因表达的诱导作用

3.7 FliCaaa蛋白及其结构域对水稻悬浮细胞ROS的诱导作用

3.8 FliCaaa蛋白及其结构域对水稻悬浮细胞介质碱性化的诱导作用

4 FliC2aaa蛋白及其不同结构域诱导水稻免疫反应的功能分析

4.1 fliC2aaa、fliC2aaa-N和fliC2aaa-C基因克隆

4.2 fliC2aaa、fliC2aaa-N和fliC2aaa-C基因表达载体的构建

4.3 目的蛋白的诱导和纯化

4.4 FliC2aaa蛋白及其结构域对水稻叶组织细胞死亡和H2O2产生的

第四章 结论与讨论

参考文献

附录1 英文缩略表

附录2：蛋白表达纯化试剂配方

附表 本研究中所用引物

致谢