盐胁迫下三角梅叶片相关生理变化及SOD基因的克隆分析

摘要

三角梅（Bougainvillea spp.）是我国南方地区重要的园林绿化树种，本研究以一年生三角梅扦插苗伊丽莎白·安格斯(Bougainvillea glabra‘Elizabeth Angus’，俗称紫花三角梅)和柔森卡(Bougainvillea×buttiana‘Rosenka’，俗称水红三角梅)为材料，用不同的盐浓度分别对2个品种三角梅进行胁迫处理，测定了三角梅2个品种叶片的在盐胁迫过程中电解质外渗率、MDA、脯氨酸、保护酶等相关生理变化，探讨三角梅耐盐性指标变化及差异；用液相色谱法对三角梅叶片中一些内源激素进行测定，研究三角梅在盐胁迫过程中激素含量的变化与盐胁迫的关系；同时用RACE的方法对三角梅叶片中SOD基因家族进行比较系统的克隆，为三角梅抗逆性研究提供分子生物学基础。主要研究结果如下：
　　1.以一年生紫花三角梅和水红三角梅扦插苗为材料，用0.2％-0.6%的盐分别对2个品种三角梅进行胁迫处理，结果表明，三角梅叶片的膜稳定性、保护酶活性、渗透调节物质含量，随处理时间和浓度的变化而规律变化。水红三角梅叶片中电解质外渗率、丙二醛、脯氨酸含量明显增加，并随时间及盐浓度的上升而增大，可溶性蛋白含量表现为先升后降，SOD的POD活性不断增高，CAT活性降低；紫花三角梅则表现为电解质外渗率、丙二醛、脯氨酸含量增加，并随时间及盐浓度的上升而增大，可溶性蛋白含量先增大后减小的趋势，SOD的POD活性先增高后下降，CAT活性降低。在胁迫过程中，紫花三角梅的上述各指标的变化较水红三角梅敏感，其上升下降的幅度更大，变化大于水红三角梅。因此电解质外渗率、丙二醛、脯氨酸与三角梅耐盐性密切相关。
　　2.利用液相色谱法对盐胁迫过程中三角梅叶片激素含量的变化进行了测定。水红三角梅叶片中ABA含量在盐胁迫下增大，0.4%和0.6%的盐处理下极显著性增大，GA3含量表现为先增长后下降的趋势，IAA含量不断减少；紫花三角梅ABA、GA3和IAA含量变化与水红三角梅相似，在0.6%的盐处理下紫花三角梅中GA3的含量远大于水红三角梅，形态学表现为多数叶片黄化脱落。因此认为GA3的含量的变化与三角梅耐盐性关系密切。
　　3.采用同源克隆的方法，利用RACE技术对三角梅SOD基因家族不同类型基因进行cDNA的克隆，结果如下：
　　CSD（Cu/ZnSOD）基因的克隆：共得到完整的质胞型CSD序列共8个，其中cyCSD1型4个，具有相同的ORF区，长585bp，编码195个氨基酸，
　　3’UTR长度为147bp-237bp不等，5’UTR长度均为55bp；cyCSD2型4个，具有相同的ORF区，长543bp，编码180个氨基酸，3’UTR长度为147bp-237bp不等，5’UTR长度均为43bp。叶绿体型CSD1个，仅获得其保守区域部分片段，长428bp。通过Blast在线比对分析，cyCSD与菠菜质胞型Cu/ZnSOD相似度84%、冰叶日中花质胞型Cu/ZnSOD相似度82%，chCSD与墙生藜叶绿体Cu/ZnSOD相似度89%、与盐角草叶绿体Cu/ZnSOD相似度87%，认为两者均是三角梅的Cu/ZnSOD序列。
　　FSD（FeSOD）基因的克隆：共得到叶绿体型FSD片段一个，长841bp。经在线blast比对分析，与Genbank上已登陆的葡萄和龙眼FSD的相似度分别达到85%和78%，认为是三角梅的FSD序列。
　　MSD（MnSOD）基因的克隆：共得到完整的线粒体型MSD序列全长共3条，具有相同的ORF，ORF长度为711bp，编码236个氨基酸，3’UTR长度282bp-314bp，5’UTR长度均为72bp。经在线blast比对分析，与Genbank上已登陆的海蓬子和盐地碱蓬的MSD相似度分别达到84%和83%，认为是三角梅的MSD序列。

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第一章 绪 论

1 园艺植物盐胁迫研究进展

1.1 盐胁迫对植物生长发育的影响

1.2 盐胁迫处理方法

1.3 与盐胁迫有关的生理指标

1.4 外源物质处理对植物耐盐性的影响

1.5分子技术在观赏植物耐盐性方面的应用

2 植物SOD基因研究进展

2.1植物SOD基因的分子克隆与表达调控

2.2 叶绿体SOD基因的转录过程

2.3 叶绿体SOD功能

3 本研究的目的和意义

第二章 三角梅2个品种在盐胁迫处理下的相关生理变化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 三角梅叶片膜系统变化

2.2 三角梅叶片抗氧化酶活性的变化

2.3 三角梅叶片渗透调节物质含量的变化

3 讨论

第三章 盐胁迫下三角梅叶片内源激素含量的测定

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 三角梅叶片ABA含量变化

2.2 三角梅叶片GA3含量变化

2.3 三角梅叶片IAA含量变化

3 讨论

第四章 三角梅超氧化物歧化酶SOD基因家族的克隆

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 三角梅SOD基因家族不同成员保守区序列的扩增

2.2 三角梅SOD 基因家族不同成员3’端的扩增

2.3 三角梅SOD基因家族不同成员5’端的扩增

2.4 三角梅SOD基因家族全长 cDNA 的验证

2.5 三角梅SOD基因生物信息学分析

3 讨论

参考文献

附录

致谢