大熊猫和奶牛粪便中纤维素降解菌的筛选与鉴定

摘要

本研究以大熊猫和中国荷斯坦奶牛粪便为实验对象，采用形态学观察、菌株的生理生化实验、菌株的分子鉴定及酶活性测定等方法，筛选大熊猫和奶牛粪便纤维素降解菌，旨在为寻找高效纤维素降解菌提供理论依据。
　　实验一：纤维素降解菌筛选。纤维素降解菌的筛选包括初筛和复筛两个阶段。初筛过程是将粪样放入到液体发酵培养基中恒温震荡培养3 d，然后将发酵液稀释并在固体培养基平板中涂布，挑取单菌落进行纯化培养，然后将纯化后的菌株滴加到固体培养基中再进行培养，之后用刚果红染色进行鉴定，选取透明水解圈较大的菌株。菌株的复筛主要是测定菌株的CMCase和FPAase两种酶的酶活性，选取酶活性较高的菌株，进行后续的鉴定。本实验分别从大熊猫和中国荷斯坦奶牛粪便样本各筛选出5株纤维素降解菌。
　　实验二：纤维素降解菌鉴定。纤维素降解菌的鉴定包括形态学观察、生理生化实验及分子生物学鉴定等三个方面。形态学观察主要包括革兰氏染色并观察菌的形状，观察菌落的颜色、形状、菌落大小、透明度、光泽度、质地、边缘特征及隆起形状等。生理生化实验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》的有关方法进行生理生化测定。包括糖醇的发酵实验、淀粉的水解实验、V-P实验、甲基红实验、氧化酶实验、接触酶实验及硝酸盐还原反应等。分子生物学鉴定主要通过聚合酶链式反应，测定基因序列，并与Genbank基因库的已知序列进行比对分析，鉴定菌株的种类。经鉴定从大熊猫和中国荷斯坦奶牛粪便中筛选得到的纤维素降解株菌分别为白色链霉菌(NC020990)、假单胞菌（NC020209）、芽孢杆菌(NC021171)、克雷伯菌(NC016612)、类芽孢杆菌(NC012914)和假单胞菌(NC020209)、志贺氏菌(NC007384)、菠萝泛菌(NC013956)、嗜麦芽寡养单胞菌(NC010943)及类芽孢杆菌(NC012914)。
　　实验三：酶活性优化测定。本实验酶活性优化因素设定为5个，分别是培养时间、培养温度、pH、接种量及装液量。通过单因素优化实验条件，测定菌株酶活性。大熊猫粪便中所筛选的菌株产酶条件及产酶结果如下：白色链霉菌(NC020990)在pH为7，温度35℃，装液量30％，接种量2.5%，摇床转速为180 rpm的条件下培养36 h, CMCase为最大值24.732 U。假单胞菌（NC020209）在pH为6，温度25℃，装液量30%，接种量4%，摇床转速为180 rpm的条件下培养36 h，CMCase为最大值24.362 U。芽孢杆菌(NC021171)在pH为6.5，温度30℃，装液量30%，接种量2%，摇床转速为180 rpm的条件下培养30h,CMCase为最大值23.125 U。克雷伯菌(NC016612)在pH为6.5，温度30℃，装液量30%，接种量2%，摇床转速为180 rpm的条件下培养42 h，CMCase为最大值18.642 U。类芽孢杆菌(NC012914) 在pH为7，温度30℃，装液量30%，接种量2%，摇床转速为180 rpm的条件下培养48h，CMCase为最大值9.234 U
　　通过单因素优化实验条件，测定菌株酶活性，中国荷斯坦奶牛粪便中所筛选的菌株产酶条件及产酶结果如下：假单胞菌(NC020209)在pH为6，温度25℃，装液量30%，接种量4%，摇床转速为180 rpm的条件下培养36 h, CMCase为最大值23.156 U。志贺氏菌(NC007384)在pH为7，温度为35℃，装液量40%，接种量2.5%，摇床转速为180 rpm的条件下培养42h，CMCase为最大值21.842U。菠萝泛菌(NC013956)在pH为6.5，温度30℃，装液量30%，接种量3%，摇床转速为180 rpm的条件下培养36h，CMCase为最大值10.624 U。嗜麦芽寡养单胞菌(NC010943)在pH为6.5，温度35℃，装液量30%，接种量2.5%，摇床转速为180 rpm的条件下培养36 h，CMCase为最大值9.942 U。类芽孢杆菌(NC012914)在pH为7，温度30℃，装液量30%，接种量2%，摇床转速为180 rpm的条件下培养48 h, CMCCase为最大值9.146 U。

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第一章 文献综述

1前言

1.1我国纤维资源现状

1.2纤维的结构及降解菌

1.3纤维素酶系

1.4纤维素酶的应用

1.5 纤维素酶的研究进展

1.6本课题研究的目的和意义

第二章 纤维素降解菌的筛选

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的初筛结果

2.2 纤维素降解菌的复筛

第三章 菌株的鉴定及生物学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 奶牛粪便中菌株生理生化特性

2.2 大熊猫粪便中菌株生理生化特性

第四章 纤维素降解菌酶活性比较分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 奶牛粪便中菌株酶活力测定

2.2 大熊猫粪便中菌株酶活测定

2.3大熊猫和奶牛粪便中菌株酶活力比较分析

第五章 全文结论

1 结论

2.本实验的创新点

3、前景展望

附录一 纤维降解菌拉丁文名对照表

参考文献

致谢