西方蜜蜂(Apismellifera)不同级型蜕皮激素早期应答因子ecr和usp的表达及功能分析

摘要

蜕皮激素（MH）是蜕皮酮及其类似物的总称，类固醇激素羟基蜕皮酮（20E）是其主要活性形式。蜕皮激素在调控昆虫变态过程中发挥着核心作用，昆虫依靠体内蜕皮激素滴度变化，调控整个变态发育历程。本课题通过对蜕皮激素受体（EcR）与超气门蛋白（USP）基因在西方蜜蜂三型蜂的不同发育历期的表达规律进行研究，同时，我们利用RNA干扰技术进一步的对EcR与USP基因的表达机制进行分析。具体结果如下：
　　为探究蜕皮激素早期应答因子ecr和usp在不同级型的西方蜜蜂体内的时空表达情况及其他相关生物学功能和作用，本研究通过荧光定量PCR技术对不同级型、发育时期的西方蜜蜂中的ecr与usp表达水平进行检测。结果表明，ecr、usp在工蜂小幼虫体内的表达与参照相同，随后稍有增加，但在变态期急剧降至最低水平，而后的蛹期又逐步增加，在成年蜂时期的表达持续维持在较高水平；蜂王体内的变化趋势与工蜂基本类似，所不同的是各阶段的表达量都显著高于工蜂，且在产卵王体内的表达显著高于处女蜂王；雄蜂体内ecr的表达在小幼虫时期稍高，但此后至蛹期都一直处于较低的表达水平，至蛹后期才稍有增加，但羽化后水平较低，老龄雄蜂体内又稍有提高。但usp在雄蜂体内的表达却基本呈现出与发育时期无关的高表达，大致为参照的283倍。ecr与usp在三型蜂体内的这种表达模式揭示了MH不仅调控蜜蜂生长发育、蜕皮变态，还可能与蜜蜂的生殖有关，而usp在雄蜂体内的表达说明USP除了与EcR组成活性复合体参与MH调控蜕皮与生殖外，还可能具有其他的生物学功能。
　　为了进一步研究EcR在西方蜜蜂三型蜂体内的各个生物学功能，揭示其表达机制，本课题利用试剂盒合成dsRNA对ecr进行干扰试验。通过向工蜂3日龄小幼虫注射5μg/μL的dsRNA1μL，分别在12h、24h、36h、48h统计各组死亡数，并在两组各取存活幼虫进行半定量跑胶验证。但从凝胶电泳图上对比发现，试验组与对照组并无明显差异。
　　本课题利用荧光定量技术分析了EcR与USP在西方蜜蜂三型蜂各个发育历期的表达情况，EcR在三型蜂体内都表现出明显的时空特异性，但在成蜂阶段，工蜂表达量基本保持不变，雄蜂从初羽化的低表达量到成熟期成倍增长至与工蜂基本相当的水平，蜂王从刚羽化至产卵阶段也处于表达增加的趋势，只是表达量更高，说明EcR与蜜蜂的生殖有关；USP在三型蜂中表达差异极显著，在雄蜂体内普遍差异不大的高表达，蜂王体内是时相性的高表达，工蜂体内时相性的低表达。这说明USP除了与EcR组成活性复合体参与MH调控蜕皮与生殖外，还可能参与其他生长和发育的调控。在利用双链RNA注射干扰西方蜜蜂工蜂3日龄小幼虫体内EcR的试验中，试验组与对照组ecr基因的表达量无差异，其结果显示ecr可能在蜜蜂变态发育中扮演着重要角色，机体有相应的补偿机制，基因无法被显著沉默。

目录

声明

第一章 文献综述

1 蜕皮激素

1.1 蜕皮激素的种类及功能

1.2 蜕皮激素在蜜蜂体内的周期性变化

1.3 蜕皮激素的合成与代谢

2 蜕皮激素受体与超气门蛋白

2.1 EcR与USP的结构特征

2.2 EcR/USP复合体与蜕皮激素信号的传导

2.3 EcR与USP在变态发育中的作用

2.4 EcR与USP的研究前景与意义

3 荧光定量

3.1 荧光定量的原理与应用

3.2 荧光定量方法

4 基因干扰技术及其在蜜蜂RNAi中的应用

4.1 基因干扰技术的原理与应用

4.2 试剂盒合成dsRNA介导RNAi

5 本论文拟解决的问题

第二章 西方蜜蜂体内EcR与USP基因的表达

1 材料与方法

1.1实验材料

1.2 实验方法

2实验结果与分析

2.1 ecr、usp定量引物验证

2.2 定量引物特异性检验

2.3 建立标准曲线

2.4 ecr在西方蜜蜂体内各时期的表达

2.5 ecr在3种级型之间的表达差异

2.6 usp在西方蜜蜂体内各时期的表达

2.7 usp在3种级型之间的表达差异

3 讨论

第三章 利用试剂盒合成dsRNA干扰西方蜜蜂ecr的研究

1 材料与方法

1.1实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果与分析

2.1 ecr的PCR扩增、质粒重组及基因克隆

2.2 ecr和egfp dsRNA的合成

2.3 dsRNA注射干扰结果

3 讨论

第四章 总结与展望

参考文献

附录

致谢