温度与SA对龙眼培养细胞类黄酮和类胡萝卜素的影响

摘要

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国亚热带地区名贵特色果树，其果实富含类黄酮、多酚和类胡萝卜素等多种营养成分，是一种药食两用作物。龙眼胚性培养物具有生长速度快，增殖系数大，再生能力强等诸多优点，可应用于龙眼次生代谢物生产。此外，研究表明植物次生代谢物的积累往往受逆境胁迫的影响。本研究以龙眼胚性培养物为研究对象，研究温度与SA对类黄酮和类胡萝卜素积累的影响，同时研究在培养过程中细胞形态、细胞保护酶活性、类黄酮和类胡萝卜素相关合成基因表达的变化。希望本研究能为离体生产龙眼类黄酮和类胡萝卜素等次生代谢物质提供理论指导。主要结果如下：
　　1.培养温度和SA浓度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响。以龙眼‘红核子’胚性愈伤组织为试验材料，分别研究培养时间、培养温度与SA浓度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响。试验结果表明：培养时间为30 d时龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累量最高；恒温30/30℃培养下龙眼胚性愈伤组织中类黄酮与类胡萝卜素积累量最高，变温35/20℃培养下龙眼胚性愈伤组织中类黄酮积累量最高，变温30/20℃培养下龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素积累量最高；培养基中 SA浓度为0.50、1.00、1.50和2.00 mg·L-1时龙眼胚性愈伤组织中类黄酮积累量最高，SA浓度为2.50 mg·L-1时龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素积累量最高。
　　2.培养温度与SA添加时间对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响。以龙眼‘红核子’胚性悬浮细胞为试验材料，以温度和SA对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累的研究结果为基础，研究SA添加时间对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响以及温度与SA配伍作用对龙眼悬浮细胞中类黄酮与类胡萝卜素积累的影响。试验结果表明：在第2 d向培养基中加入2.00 mg·L-1的SA时龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素积累量最高；在恒温30/30℃培养的第2 d加入培养基中添加2.00 mg·L-1的SA时，龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮与类胡萝卜素积累量分别极显著高于恒温30/30℃和25/25℃培养下。
　　3.培养时间与温度及SA浓度对龙眼胚性愈伤组织增殖的影响。以龙眼‘红核子’胚性愈伤组织为试验材料，分别研究培养时间、温度和SA浓度对龙眼胚性愈伤组织增殖的影响。试验结果表明：培养时间为50 d时，龙眼胚性愈伤组织增殖系数最大；恒温35/35℃培养下龙眼胚性愈伤组织的增殖系数最大，变温35/20℃培养下龙眼胚性愈伤组织的增殖系数最大；培养基中SA浓度为2.00 mg·L-1和1.50 mg·L-1时龙眼胚性愈伤组织的增殖系数最大。
　　4.温度与SA对龙眼胚性愈伤组织中细胞保护酶活性的影响。以龙眼‘红核子’胚性愈伤组织为试验材料，研究不同温度和SA浓度培养第30 d时龙眼胚性愈伤组织中SOD、CAT、POD细胞保护酶活性的变化。试验结果表明：恒温培养下，龙眼胚性愈伤组织中SOD酶的活性为25/25℃<20/20℃<30/30℃<35/35℃，POD酶的活性为25/25℃<20/20℃<30/30℃<35/35℃， CAT酶的活性为20/20℃<25/25℃<30/30℃<35/35℃；变温条件下 SOD、POD、CAT酶活性均为20/20℃<25/25℃<30/20℃<35/20℃；随着培养基中SA浓度的升高，龙眼胚性愈伤组织中SOD、POD、CAT酶的活性均呈现先升高后降低的趋势，培养基中SA浓度为1.50 mg·L-1时龙眼胚性愈伤组织中SOD酶的活性最高，培养基中SA浓度为1.00 mg·L-1时POD酶的活性最高，培养基中SA浓度为1.00和1.50 mg·L-1时CAT酶的活性最高。
　　5.温度与SA对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响及相关性分析。以龙眼‘红核子’胚性愈伤组织为试验材料，研究不同温度和SA浓度培养第30 d时龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响及最优温度和最优SA浓度培养下不同生长阶段的龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达相关性。试验结果表明：在不同温度与SA浓度培养第30 d的龙眼胚性愈伤组织中，CHS表达量、DFR表达量均与类黄酮含量变化呈正相关关系，GGPS表达量、PSY表达量均与类胡萝卜素含量变化呈正相关关系。在最优培养温度（30/30℃）下的龙眼胚性愈伤组织在生长第25、30 d时CHS表达量、CHI表达量、F3H表达量、DFR表达量呈两两正相关正相关关系；在最优培养温度（30/30℃）下龙眼胚性愈伤组织中的GGPS表达量、PSY表达量、PDS表达量、ZDS表达量始终呈两两正相关关系；在最优SA浓度（1.50 mg·L-1的SA）培养下龙眼胚性愈伤组织中CHS表达量与CHI表达量、F3H表达量与DFR、GGPS表达量与PSY表达量、PDS表达量与ZDS表达量始终呈两两正相关关系。
　　6.温度与SA对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响及相关性分析。以龙眼‘红核子’胚性悬浮细胞为试验材料，研究SA与温度对不同生长阶段的龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响及相关性分析。试验结果表明：在温度与SA的作用下，生长10 d的龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮积累量与 CHI、CHS、F3H、DFR基因的稳定性高表达有关；在温度与SA的作用下，龙眼胚性悬浮细胞生长的8、10 d时CHI表达量分别与CHS表达量、F3H表达量、DFR表达量呈两两负相关关系。在温度与SA的作用下，生长10 d的龙眼胚性悬浮细胞中类胡萝卜素含量的显著升高与GGPS、PSY、PDS、ZDS基因在胚性悬浮细胞生长2、4 d时的高表达有关；在温度与SA的作用下，龙眼胚性悬浮细胞在生长的第2、4、6 d时PSY表达量、PDS表达量、ZDS表达量呈两两正相关关系；在温度与SA的作用下，龙眼胚性悬浮细胞在生长过程中GGPS表达量与PSY表达量在始终呈现高度的正相关关系。
　　深入开展龙眼胚性培养物中类黄酮与类胡萝卜素物质积累的研究，可以更加规范的开展龙眼类黄酮与类胡萝卜素的生产工作，可以建立科学、高效的工厂化生产流程，提高企业生产效率和企业竞争力。对于充分挖掘中医药资源、推动中医药的现代化和国际化具有重要意义。龙眼基因组数据库公布对于深入开展龙眼中类黄酮与类胡萝卜素的研究提供了新的平台与机遇。

目录

声明

缩写词

第一章 引言

1 植物次生代谢物质

2 龙眼次生代谢研究进展

3 逆境胁迫与植物次生代谢

4 本研究主要意义和内容

第二章 龙眼胚性愈伤组织培养条件的优化

第一节 培养时间龙眼胚性愈伤组织生长的影响

第二节 温度对龙眼胚性愈伤组织增殖的影响

第三节 SA浓度对龙眼胚性愈伤组织增殖的影响

第三章 培养温度和SA浓度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮与类胡萝卜素积累的影响

第一节 龙眼胚性愈伤组织类胡萝卜素提取方法的优化

第二节 培养时间对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响

第三节 培养温度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响

第四节 SA浓度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响

第四章 温度与SA对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响

第一节 SA添加时间对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响

第二节 温度与SA对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素积累的影响

第五章 培养温度与SA浓度对龙眼胚性愈伤组织中细胞保护酶活性的影响

第一节 培养温度对龙眼胚性愈伤组织中细胞保护酶活性的影响

第二节 SA浓度对龙眼胚性愈伤组织中细胞保护酶活性的影响

第六章 温度与SA对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响

第一节 温度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响

第二节 优化的温度条件下对不同生长阶段的龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝素合成相关基因表达分析

第三节 SA浓度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响

第四节 优化的SA浓度下对不同生长阶段的龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达分析

第七章 温度与SA对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因的表达分析

第一节 温度与SA对龙眼胚性悬浮细胞中类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因的表达分析

第八章 小结与展望

1 小结

2 展望

参考文献

附录A 本研究使用的基因序列

附录B 本研究使用引物及相关信息

附录C 图版说明

附录D 图版

致谢