miPEPs在龙眼体胚发生过程中的应用研究

摘要

龙眼（Dimocarpus longan Lour.），是我国南亚热带地区名贵果树。龙眼果核大小、坐果率、果实品质及产量等决定于其胚胎发育状况的优良与否。龙眼体细胞胚胎发生系统可作为其重要的替代模式系统解决龙眼早期胚胎在遗传上的高度杂合问题。目前在农业生产上，由mRNA编码的植物多肽作为一种新型肥料，能明显增加产量并提高品质。已有研究表明由pri-miRNA编码的miPEP对植物相关miRNA的表达和形态建成等方面均有较大影响。目前龙眼中尚未有研究，本试验以龙眼体胚发生系统为基础，主要研究结果如下：
　　1.龙眼pri-miRNA全长序列的获得及生物信息学分析。利用RLM-RACE技术，对16个miRNA使用GeneRACE反转录试剂盒，分别获得3，UTR8条和5，UTR10条，使用SMART?RACE试剂盒分别获得3，UTR3条和5，UTR5条；克隆获得pri-miRNA全长序列10条。通过对18个pri-miRNA确定转录起始位点，发现它们均含有不少于1个转录起始位点，转录起始位点数量存在差异。对18个pri-miRNA的启动子分析，发现它们均含有激素响应顺式作用元件，且均含有赤霉素和茉莉酸甲酯顺式作用元件但种类和元件个数存在差异。
　　2.龙眼19个pre-miRNA的表达模式分析。19个pre-miRNA在龙眼EC、IcpEC、CpECGE和GE4个不同发育阶段表达模式分析发现：除pre-miR156-scaffold29和pre-miR156e*-scaffold3未检测到表达外，有表达的17个pre-miRNA在 IcpEC和 CpECGE表达均不高。在龙眼 EC阶段中， pre-miR168a-scaffold2621、 pre-miR2118a-scaffold26、 pre-miR170-scaffold1266和pre-miR396a-scaffold38相对表达量较高。发育至IcpEC阶段，17个pre-miRNA的相对表达量均不高；发育至CpECGE时，除pre-miR395a-scaffold6相对表达量略高些，其他16个pre-miRNA表达量较低。发育至 GE阶段， pre-miR160a-scaffold209、pre-miR390a-scaffold24、 pre-miR319a-scaffold517和 pre-miR482a-scaffold26表现出较高的表达量。比较19个pre-miRNA在‘红核子’龙眼不同器官的表达模式，发现19个 pre-miRNA除 pre-miR156-scaffold29、pre-miR156e*-scaffold38和 pre-miR398b-scaffold58未检测出外，有表达的pre-miRNA多数多花的生长发育具有较大的调控作用，在其他器官中不同pre-miRNA存在差异。对18个pri-miRNA启动子中均有激素顺式作用元件，有响应的各pre-miRNA效果存在差异。分别用0.5 mg/L2,4-D、2.0 mg/L赤霉素、1.0 mg/L吲哚乙酸、25μmol/L水杨酸、10μmol/L脱落酸和25μmol/L茉莉酸甲酯对龙眼愈伤组织处理24 h后发现：pre-miR319-scaffold517在生长素2,4-D、吲哚乙酸和赤霉素处理下，其相对表达量均有明显促进作用。pre-miR168a-scaffold2621在生长素2,4-D和吲哚乙酸处理中表达量具明显促进作用。生长素2,4-D处理对pre-miR482a-scaffold26则表现出明显的抑制效果。吲哚乙酸处理下，对 pre-miR168a-scaffold2621、pre-miR170-scaffold1266和 pre-miR319-scaffold517的表达有促进效果。在水杨酸处理下， pre-miR398b-scaffold58表达量受抑制。在赤霉素处理下，对pre-miR160-scaffold209和pre-miR171f-scaffold537的表达具有极显著的抑制表达效果，而对 pre-miR319-scaffold517、pre-miR394a-scaffold3884、pre-miR395a-scaffold6和pre-miR396a-scaffold38则促进效果极明显。在茉莉酸甲酯处理中，pre-miR395a-scaffold6的表达抑制效果明显。
　　3.miPEP在龙眼体胚发生过程中的研究。采用15μmol/L由 pri-miR319不同转录起始位点编码的miPEP319-1、miPEP319-2和miPEP319-3连续处理龙眼愈伤组织处理3 d，结果显示： miPEP319-2对龙眼miR319家族的3个成员表达量均有明显的抑制效果，miPEP319-1和miPEP319-3影响较小。探究不同浓度miPEP319-2对龙眼体胚中miR319家族成员表达影响。结果发现0.4μmol/L miPEP319-2对miR319家族成员表达均有促进作用，且对miR319c促进效果最明显。探究处理时间对miR319家族成员表达的影响，结果发现：在24 h内，不同时间对miR319家族中成员表达量有促进效果，但促进效果较缓慢。探究不同氨基酸序列对miR319家族表达影响，发现0.4μmol/L miPEP319-2和miPEP319-2这两种均能促进miR319家族的不同成员的表达，但促进的程度存在差异。
　　4.miPEP319在龙眼体胚发生中的应用研究。选取具有多个转录起始位点且对植物的形态建成以及抗逆性均有较大的影响的miR319，探究pri-miR319编码的miPEP319对龙眼悬浮培养周期内的应用。结果发现，在龙眼体胚发生早期，miPEP319-2和scrambled miPEP319-2处理对miR319c的作用效果更明显，同时抑制龙眼 pre-miR319a-scaffold517、 pre-miR319a-scaffold1667和pre-miR319a-scaffold1709的表达。miPEP319-2对Dlo_022819_TCP4和 Dlo_025379-GMMY的表达具有抑制表达的效果，而对Dlo_020213_TCP4、Dlo_026743_TCP4和 Dlo_021198.2-GMMYB3个靶标的表达却能促进表达。scrambled miPEP319-2除对Dlo_020213_TCP4有促进效果外，对其他4个靶标的表达均为抑制作用。形态上发现用scrambled miPEP319-2和miPEP319-2处理，龙眼细胞团颗粒变大，且颜色变深，显微观察发现细胞排列更紧密，细胞大小不均匀。
　　龙眼pri-miR319不同转录起始位点编码的miPEP对龙眼体胚发生的影响。结果发现：miPEP319-2和miPEP319-3对龙眼miR319家族成员、pre-miR319以及靶标作用效果相似，miPEP319-1与这二者之间作用效果存在差异：miPEP319-1促进miR319家族3个成员的表达；抑制 pre-miR319a-scaffold213、 pre-miR319a-scaffold517、pre-miR319a-scaffold1667和pre-miR319a-scaffold1709的表达；促进靶标Dlo_026743_TCP4表达。可见，pri-miR319转录起始位点编码的miPEP均有活性，且对龙眼体胚发生过程中作用效果不同。
　　以miPEP319对龙眼体胚发生过程的影响为基础，探究miPEP对龙眼体胚发生过程中的调控作用，以期实现将龙眼pri-miRNA编码的不同miPEPs能以肥料的形式大批量应用于生产中，解决龙眼生产过程中存在的问题，实现高效、便捷地提高龙眼生产效益。

目录

声明

缩写词

第一章 引言

1植物多肽的研究进展

2 植物miRNA研究进展

3 本研究的意义和主要内容

第二章 龙眼pri-miRNA全长序列的获得及生物信息学分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 龙眼19个pre-miRNA的表达模式分析

第一节 19个候选pre-miRNA在龙眼体胚发生过程中的差异表达

第二节 19个pre-miRNA在‘红核子’龙眼不同组织器官中的差异表达

第三节 龙眼19个候选pre-miRNA在激素胁迫下的表达模式

第四章 miPEP319在龙眼体胚发生过程中对miR319家族成员表达的研究

第一节 不同转录起始位点miPEP319对龙眼体胚中miR319家族成员的影响

第二节 miPEP319-2对龙眼体胚中miR319家族成员的影响

第五章 miPEP319调控龙眼体胚发生作用研究

第一节 miPEP319-2在龙眼体胚发生早期的影响

第二节 miPEP319不同转录起始位点对龙眼体胚发生早期功能影响

第六章 小结与展望

1 小结

2展望

参考文献

在硕士期间发表论文情况

致谢

附录