AMPK/ULK1/Beclin1途径介导番鸭呼肠孤病毒诱导Vero细胞自噬的机制研究

摘要

番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae），正呼肠孤病毒属（Orthoreovirus），该病毒可引起4~45日龄的雏番鸭以软脚、肝脾灰白色坏死点为特征、高发病率和高死亡率的急性传染病，给番鸭养殖产业造成了重大经济损失。细胞自噬是真核细胞中降解细胞内底物的一类保守性活动，其可以参与多种细胞生理学过程，并维持细胞的自我平衡。目前对鸡呼肠孤病毒（CRV）的研究比较深入，有文献报道，CRV p17蛋白作为细胞自噬的正向调控因子，可以通过启动AMPK信号通路来引发细胞自噬借以增强病毒的复制。本团队前期研究表明MDRV-σNS蛋白也可以诱发细胞自噬并促进病毒增殖。MDRV和CRV同属于禽正呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV），但二者编码的蛋白存在一定的差异，MDRV S组蛋白不含有p17编码基因，其诱导自噬并促进病毒复制的具体机制可能与CRV有所不同，目前尚没有相关研究报道。为此，本课题通过电镜技术、siRNA基因沉默技术和Western Blot方法探索AMPK信号通路对MDRV及σNS蛋白诱导Vero细胞发生自噬过程中发挥的调控作用，明晰其调控的分子机制。其主要实验内容和结果如下： 1、透射电镜观察自噬 收集培养36h的空白组和感染组Vero细胞，经2.5%戊二醛固定液固定，制备超薄切片，在透射电子显微镜下观察自噬体的形态学结构。结果显示，与空白组细胞相比，MDRV感染细胞中可见典型的包裹胞浆成分的双层膜结构，从形态学角度证实MDRV可以诱导Vero细胞产生自噬。 2、MDRV对Vero细胞AMPK/ULK1/Beclin1信号通路的影响 本研究以Vero细胞为模型，运用Western Blot方法检测MDRV感染36h的Vero细胞内AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、ULK1、p-ULK1、Beclin1、LC3II等与细胞自噬及AMPK/ULK1/Beclin1通路相关的蛋白表达水平的变化情况。试验结果显示，（1）与空白对照组相比，MDRV感染组检测到MDRV-σNS蛋白，表明病毒进入Vero细胞并进行复制；（2）与空白对照组相比，MDRV感染组的LC3Ⅱ蛋白表达水平明显增高，说明MDRV感染可以诱导Vero细胞发生自噬；（3）与空白对照组相比，MDRV感染组总AMPK、mTOR、ULK1蛋白表达水平基本相同，而p-AMPK和Beclin1蛋白表达水平上调，p-ULK1和p-mTOR蛋白表达水平下调。试验初步表明MDRV可诱导Vero细胞发生自噬，且AMPK/ULK1/Beclin1通路参与其中。 3、MDRV感染Vero细胞对AMPK/ULK1/Beclin1通路的影响 为了进一步研究MDRV感染Vero细胞对AMPK信号通路的影响，我们采用了siRNA沉默技术，在AMPK激活剂AICAR对Vero细胞分别预先处理下，对AMPK、ULK1、Beclin1基因进行沉默并转染，随后进行病毒感染；在感染36h通过Western Blot方法分别检测对MDRV感染的各组样本中与细胞自噬、AMPK通路相关的蛋白表达水平的影响。试验结果显示，（1）转染sh-AMPK后，sh-AMPK组与空白组相比，AMPK和p-AMPK表达水平显著下调，mTOR和p-mTOR表达水平变化不显著，表明转染sh-AMPK可以有效抑制细胞内AMPK蛋白表达；与MDRV感染组相比，MDRV+sh-AMPK组细胞内总AMPK蛋白表达水平下调，mTOR变化不显著，而p-AMPK、LC3Ⅱ和p-mTOR的表达水平下降，表明转染sh-AMPK以后，AMPK信号通路受到负向调控，抑制自噬。（2）用AMPK激活剂AICAR预处理细胞后，与空白对照组相比，AICAR组AMPK、p-AMPK和LC3Ⅱ达水平变化显著上调，而mTOR的表达水平变化不显著，表明AICAR可以有效的促进AMPK、p-AMPK表达；与MDRV对照组相比，MDRV+AICAR组的总AMPK、p-AMPK和LC3Ⅱ表达水平相对较高，总mTOR表达水平变化不显著，p-mTOR的表达水平下降，表明AMPK激活以后，AMPK/ULK1/Beclin1信号通路受到正向调控，发生自噬；（3）转染sh-ULK1后，与空白组相比，sh-ULK1组ULK1和p-ULK1表达水平显著下调，Beclin1和LC3Ⅱ表达水平上调，表明转染sh-ULK1可以有效抑制细胞内ULK1蛋白表达；与MDRV感染组相比，MDRV+sh-ULK1组的ULK1和p-ULK1蛋白表达水平下调，而Beclin1和LC3Ⅱ的蛋白表达水平升高，表明将ULK1沉默以后，AMPK/ULK1/Beclin1信号通路受到正向调控，发生自噬；（4）转染sh-Beclin1后，与空白对照组相比，sh-Beclin1组的Beclin1表达水平显著下调，表明转染sh-Beclin1可以有效抑制细胞内Beclin1蛋白表达；与MDRV组相比，MDRV+siBeclin1组Beclin1、LC3Ⅱ的表达水平下调，表明将Beclin1沉默以后，AMPK/ULK1/Beclin1信号通路受到负向调控，抑制自噬。上述结果表明，MDRV感染Vero细胞在AMPK/ULK1/Beclin1通路的影响下发生自噬。 4、MDRV-σNS蛋白对Vero细胞AMPK/ULK1/Beclin1自噬信号通路的影响 本课题组已证实MDRV-σNS蛋白能够诱导禽源细胞发生自噬（结果在Virology Journal上发表），为了进一步探讨MDRV-σNS蛋白诱导细胞自噬是与AMPK信号通路的相互关系，本研究将本实验室已经构建的MDRV-σNS蛋白基因的真核表达质粒pCI-flag-σNS转染Vero细胞，36h后收集细胞，透射电镜观察自噬；然后，采用siRNA沉默技术，在AMPK激活剂AICAR对Vero细胞分别预先处理下，对AMPK、ULK1、Beclin1基因进行沉默并转染，随后进行pCI-flag-σNS质粒转染，在转染后，培养36h，通过Western Blot方法分别检测对（siAMPK、siULK1、siBeclin1）转染的各组样本中与细胞自噬、AMPK通路相关的蛋白表达水平的影响。结果显示，（1）透射电镜观察，转染pCI-flag-σNS可见包裹胞浆的双层膜结构，而空白组没有发现，从形态学上证实MDRV非结构蛋白σNS可以诱导Vero细胞自噬；（2）转染pCI-flag-σNS，与空白对照组相比，p-AMPK、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白水平的表达上调，p-mTOR和p-ULK1蛋白表达水平下调，从分子水平上证实了MDRV非结构蛋白σNS可以诱导Vero细胞自噬，也初步显示与AMPK/ULK1/Beclin1通路有关；（3）转染sh-AMPK和sh-Beclin1后，与MDRV-σNS组相比，LC3Ⅱ蛋白水平表达下降，表明转染sh-AMPK和sh-Beclin1降低细胞自噬水平；转染sh-ULK1和AICAR预处理后，与MDRV-σNS组相比，LC3Ⅱ蛋白水平表达上调，表明转染sh-ulk1和AICAR处理可促进细胞自噬水平；上述结果进一步证实了MDRV非结构蛋白σNS在AMPK/ULK1/Beclin1通路的影响下促进Vero细胞发生自噬。 5、结论 MDRV及其非结构蛋白σNS能够诱导Vero细胞发生自噬，并且是通过促进AMPK蛋白磷酸化、抑制ULK1蛋白磷酸化、以及促进Beclin1蛋白表达，进一步调控AMPK/ULK1/Beclin1信号通路的方式诱导Vero细胞自噬。