生长素结合蛋白与磷感应蛋白复合物的表达纯化和结晶

摘要

第一篇，拟南芥生长素结合蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化。 随着基因工程技术的广泛运用，外源基因的高效表达开始成为人们关注的焦点。大肠杆菌表达系统以培养周期短，成本低廉等特点应用到社会各领域中。但许多真核蛋白都不能够在原核系统中正常表达，因此，开发并熟练运用一套真核表达系统非常重要。 生长素是植物生长发育中重要的生长激素，能够与生长素结合的一类蛋白质在生长素信号转导途径中起重要作用。本研究尝试了真核和原核两种表达系统来表达生长素结合蛋白。在原核表达系统中：生长素结合蛋白表现为难溶状态，加上助溶标签后能促进目的蛋白的溶解，分子筛层析色谱显示这些蛋白是高度聚合的。在昆虫细胞表达系统中：生长素结合蛋白表现为可溶状态，分子筛层析色谱显示蛋白行为状态较好。此外，本研究还通过分泌途径成功表达了生长素结合蛋白Auxin Binding Protein1和Transmembrane Kinase1胞外域，并鉴定了二者的体外互作。结果显示在pH5.7和NAA参与的条件下，分子筛无法检测到Auxin Binding Protein1和Transmembrane Kinase1的互作。这表明二者互作可能比较弱，或者其互作还依赖于其他蛋白的参与。 本研究成功建立起一套昆虫细胞表达系统，可用来表达更多有应用价值的蛋白质，为生物医学工程、制药工程、农药工程等领域提供了一套高效的真核表达系统。此外，本研究为生长素信号转导领域的功能研究提供了重要的研究基础。 第二篇，酵母磷感应蛋白复合物的表达、体外装配和纯化结晶。 利用大肠杆菌作为宿主细胞表达异源目的蛋白具有培养方便、价格低廉等诸多优点，然而大肠杆菌在表达目的基因的过程中也会遇到各种各样的困难，且多元蛋白在大肠杆菌中的共表达也鲜有报道，探索并优化多元蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有极其重要的研究价值和应用价值。 本研究建立了以多基因表达盒为基础的共表达载体的构建方法，探索并优化了磷感应蛋白的多元复合物在大肠杆菌中高效表达的各种方法。本研究首先尝试了磷感应蛋白PHO81全长及PHO81多个片段在大肠杆菌中的表达。PHO81全长蛋白在大肠杆菌中可溶，但表达量很低。PHO81多个不同片段的溶解度测试结果显示，这些截取的片段表达为难溶蛋白。PHO81其中一个结构域PHO81-MD蛋白在大肠杆菌中表达状态最佳。此外，本研究利用共表达技术表达纯化了磷感应蛋白复合物中的核心蛋白PHO80与PHO85并获得了PHO80-PHO85复合物的晶体。PHO80-PHO85与PHO81-MD结构域的体外互作试验显示PHO81与PHO80-PHO85之间存在很强的互作。 本研究实现了二元蛋白复合物及三元蛋白复合物在大肠杆菌中的有效表达和纯化，并且获得了磷感应蛋白二元复合物的晶体。本研究为多元蛋白在大肠杆菌中的高效表达提供了研究基础，为纯化酵母磷感应相关蛋白和解析PHO81作为激酶抑制剂的分子机制提供了蛋白纯化和晶体筛选的经验基础。

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