脱氧核酶的可视化筛选及其抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表达的实验研究

摘要

鼻咽癌是我国高发肿瘤，国内外一系列研究证明EB病毒编码的LMPl对其发生发展中起重要作用，被认为是鼻咽癌的癌基因。目前，脱氧核酶是基因治疗的一种崭新的分子生物学工具，能够将RNA分子在未配对的嘌呤和配对的嘧啶之间切断，从而调控基因的表达。本研究针对LMPlmRNA设计合成10-23型脱氧核酶(10-23DRz)，观察其在细胞内外筛选的差异性及其抑制鼻咽癌EBV-LMPl基因表达的效应。希望建立一个脱氧核酶简便可行的的荧光可视化筛选方法，并为鼻咽癌的预防和临床治疗开创一个新的方法。 目的： 1、调查研究我国西部重庆地区鼻咽癌患者及非鼻咽癌对照者外周血血浆中EB病毒LMPl基因携带情况及LMPl基因C端30个碱基缺失和N端XhoI酶切位点缺失变异情况。为进一步探讨具有缺失型LMPl的EBV与鼻咽癌的相关性提供实验依据。 2、选择EBV-LMPl基因为脱氧核酶治疗鼻咽癌的靶基因，针对EBV-LMPlmRNA设计合成多种10-23DRz，并对其转染效率及其在细胞内的分布情况进行评价。 3、通过体外转录技术，经细胞外分子水平切割筛选具有高效性和特异性的脱氧核酶，并观察RNA碱基长度对脱氧核酶体外剪切效率的影响。为探索脱氧核酶细胞外分子水平切割筛选的优化体系提供参考。 4、构建EBV-LMPl绿色荧光融合真核表达载体，在鼻咽癌细胞中实现EBV-LMPl增强型绿色荧光融合蛋白表达。 5、在已建立的荧光可视化细胞平台上，从细胞水平再次筛选高效性和特异性的脱氧核酶；并观察脱氧核酶抑制细胞内EBV-LMPl基因表达情况及对癌细胞的生物学效应。希望建立一个脱氧核酶简便可行的的荧光可视化筛选方法，并为研究脱氧核酶在体内水平的治疗应用打下基础。 方法： 1、对48例鼻咽癌患者和40例非鼻咽癌对照者的外周血血浆进行DNA抽提，分别对LMPlC端和N端进行PCR扩增。PCR扩增产物通过PAGE胶电泳、限制性酶切、序列测定等来分析LMPlC端有无30个碱基的缺失及N端有无XhoI酶切位点的缺失变异。 2、以B95—8来源的LMPlmRNA为基础，应用RNA结构预测软件模拟预测LMPlmRNA的二级结构，选择具有高度特异性和高度保守性的环状膨出核苷酸序列为脱氧核酶结合靶序列，选择AU为切割靶点，设计10-23DRz及其对应的的突变体和反义寡聚核苷酸；将脱氧核酶5’端用FITC标记来检测脱氧核酶的转染效率及其在细胞内的分布情况；将脱氧核酶侧臂及寡聚核苷酸两端各2个碱基进行硫代修饰来增加它们的稳定性。 3、从B95—8细胞中提取总RNA及基因组DNA，分别通过RT-PCR及PCR扩增LMPlcDNA及DNA片段，构建重组T载体pMDl8-T-LMPlm和pMDl8-T-LMPId；再以重组T载体为模板，PCR扩增LMPl相关片段，构建重组体外转录载体pGEM一1lzf-LMPlm、pGEM一11zf-LMPla、pGEM一1lzf-LMPlc；将重组体外转录载体线形化后，用体外转录技术转录出LMPlmRNA；模拟体内生理条件，用设计的侯选脱氧核酶在细胞外分子水平对转录出的3种RNA模板进行剪切筛选，分析剪切效率，筛选出高效率的脱氧核酶；同时与突变体和反义寡聚核苷酸进行切割对比、与长短不同的RNA模板进行切割对比来分析脱氧核酶的特异性。 4、以重组T载体为模板，PCR扩增LMPl相关片段，构建LMPl增强型绿色荧光融合蛋白真核表达载体pEGFP-N1一LMPlm、pEGFP—C1一LMPlm、pEGFP-N1一LMPla、pEGFP-Cl—LMPlc，用脂质体转染法将它们转入鼻咽癌低分化CNE2细胞，在活细胞状态下用荧光倒置显微镜观察融合蛋白荧光表达及亚细胞分布情况；用RT-PCR及westernblot检测来验~j[LMPl荧光融合真核表达是否成功。5、将FITC标记的脱氧核酶，通过脂质体转染转入鼻咽癌细胞CNE2中，应用荧光显微镜检测脱氧核酶在细胞中的分布定位，应用流式细胞术检测脱氧核酶在细胞中的转染效率，用MTT法检测脱氧核酶的细胞毒性作用；利用已建立的荧光可视化细胞平台，将脱氧核酶与重组荧光融合真核表达载体共转染入鼻咽癌CNE2细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察荧光融合蛋白在细胞中的表达量差异，用Image-ProPlus软件进行荧光强度分析，计算荧光表达抑制率，用SPSS11．O软件统计分析，在细胞水平来筛选高效性和特异性的脱氧核酶，并与细胞外分子水平筛选结果相比较；将筛选出的高效特异的脱氧核酶与载体pEGFP-C1一LMPlm共转染入鼻咽癌CNE2细胞，通过荧光显微镜和流式细胞技术检测脱氧核酶对LMPl荧光融合蛋白表达量的影响，用MTT法检测对鼻咽癌细胞的增殖生长影响，用AO／EB法检测对鼻咽癌细胞凋亡的影响，用RT-PCR检测脱氧核酶对LMPl基因在mRNA水平的抑制作用，用westernblot检测脱氧核酶对LMPl基因在蛋白质水平的抑制作用。 结果： 1、48例NPC患者EBV-LMPl检出率为100％，40例非鼻咽癌对照者EBV-LMPl检出率为95％。鼻咽癌患者及非鼻咽癌对照者中均未发现C端30bp的缺失和N端XhoI酶切位点缺失变异。 2、针对LMPlmRNA共设计出7种脱氧核酶，其中针对exonamRNA有DZl67、DZl93、DZ211共3种，针对exoncmRNA有DZ509、DZ827、DZ893、DZl037共4种；同时设计了DZ509的突变体mut-DZ509及其反义寡聚核苷酸ASODN509和荧光标记的FITC-DZ509；所有脱氧核酶两端各2个碱基进行了硫代修饰。 3、(1)成功构建重组T载体pMDl8-T-LMPlm和pMDl8-T-LMPld及重组体外转录载体pGEM—11zf-LMPlm、pGEM一11zf-LMPla、pGEM-11zf-LMPlc；(2)细胞外分子水平剪切筛选结果：对模板LMPlexonamRNA剪切率DZl67>DZl93>DZ211；对模板LMPlexoncmRNA剪切率DZ509>DZ893~DZl037>DZ827，同时DZ509>mut-DZ509>ASODN509；DZ509对exonamRNA无剪切活性，DZl67对exoncmRNA无剪切活性；DZ509和DZl67对全长LMPlmRNA都有剪切活性，但剪切率较单纯外显子mRNA剪切率更低。 4、成功构建LMPl绿色荧光融合蛋白真核表达重组载体pEGFP-N1一LMPlm、pEGFP-C1一LMPlm、pEGFP-N1一LMPla、pEGFP-C1．LMPlc；重组载体转入CNE2细胞后可见荧光融合蛋白主要分布于细胞浆和细胞膜，部分呈颗粒状；用RT-PCR检测和westernblot检测表明LMPl融合蛋白表达成功。 结论： l、我国西部重庆地区鼻咽癌和非鼻咽癌对照者血浆中携带的EB病毒LMPl基因C端不存在30bp缺失，N端不存在XhoI酶切位点缺失变异，与我国鼻咽癌高发区广东地区和我国低发区东北地区健康携带者外周血携带的EB病毒LMPl基因相似。因此，我们认为缺失型EB病毒并没有选择性地感染鼻咽癌病人，EB病毒LMPl基因N端和C端的缺失突变，可能是在鼻咽癌的发生发展过程中产生的，并不是先有缺失突变，再选择性地感染鼻咽癌病人。至于LMPlC端30bp缺失和N端XhoI酶切位点缺失变异与鼻咽癌的相关性还需进一步研究。 2、细胞外分子水平筛选结果表明DZl67和DZ509切割LMPlmRNA具有高效性和序列特异性。脱氧核酶对长度不同的mRNA的剪切效率有差异。为更好的反应实际剪切效率，我们认为最好用全长mRNA进行二级结构预测、靶点选择及细胞外分子水平剪切筛选。这为探索脱氧核酶细胞外分子水平切割筛选的优化体系提供了实验依据。重组体外转录载体还可进一步转录出标记RNA，这为LMPl的Northernblot或Southernblot等检测研究奠定了基础。 3、利用荧光融合表达技术，我们实现了LMPl蛋白的N端部分、C端部分、及全长蛋白在鼻咽癌CNE2细胞中荧光融合表达，建立了LMPl荧光可视化鼻咽癌细胞平台。为针对LMPl的脱氧核酶在细胞水平的筛选实现荧光可视化成为可能，并为观察脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞内EBV-LMPl基因表达情况及对癌细胞的生物学效应奠定了细胞基础，并有希望用G418筛压整合，建立EBV-LMPl增强型绿色荧光融合蛋白长期稳定表达的鼻咽癌细胞株。同时为进一步研究LMPl蛋白质的亚结构功能提供了研究平台。 4、脱氧核酶可经脂质体转染进入鼻咽癌细胞，有一定的剂量依赖关系，分布于细胞浆和细胞核，对靶细胞没有明显的细胞毒性，具有潜在的开发和应用价值。 5、细胞内水平荧光可视化筛选结果表明DZl67和DZ509抑制LMPl基因荧光融合表达具有高效性和特异性，与细胞外分子水平筛选结果一致。表明荧光可视化的细胞水平筛选是脱氧核酶的一种可行的筛选方法。 6、脱氧核酶DZl67和DZ509能够在鼻咽癌细胞内抑制EBV-LMPl基因mRNA水平和蛋白水平的表达，促进鼻咽癌细胞的凋亡，抑制鼻咽癌细胞的生长。为今后进一步研究脱氧核酶在体内的应用治疗打下基础。本研究也证实以EBV-LMPl基因为靶分子的脱氧核酶可能成为鼻咽癌等EBV相关肿瘤的新型基因治疗工具。

目录

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英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分重庆市鼻咽癌患者血液EBV-LMP1基因缺失变异初步研究

第二部分抑制EBV-LMP1 mRNA的脱氧核酶的设计和构建

第三部分脱氧核酶细胞外分子水平切割筛选

第四部分EBV-LMP1荧光融合真核表达载体的构建及表达

第五部分DZ在细胞内的荧光可视化筛选及其抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1基因表达的效应观察

全文研究总结

本研究创新性评价

附件论文EBV-LMP1基因重组原核表达载体的构建

文献综述一EB病毒潜伏膜蛋白1与鼻咽癌的发生发展

文献综述二脱氧核酶及其应用进展

致谢

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