血清精氨酸代琥珀酸裂解酶活性速率法的建立及临床应用

摘要

肝病为威胁人类健康的主要疾病之一，中国是肝病大国，肝癌是中国恶性肿瘤的第二号“杀手”。全世界每年新增约100万肝癌患者，其中一半发生在中国。单就乙型肝炎而言，全球有三亿多感染者，中国则有一亿五千万之多，近全球一半，占我国总人口的9％以上，其中有1/4是慢性乙型肝炎患者，大约是三千余万，不少因未能诊断出而长期隐匿在正常人群中，严重影响患者本人的生活质量和他人的身体健康。可见肝病对人类的危害，已成为亟待解决的问题。 肝病早期患者多以肝细胞不同程度损伤为主，缺乏明显的临床症状、体征及影像学改变。因此，肝病的早期主要依靠实验诊断，血清酶学检查是其首选指标。据文献报告，至今已研究探讨用于临床诊断肝脏疾病的酶学指标已有几十种，但大多数均因种种原因未被临床医生接受。目前用作反映肝细胞损伤的血清酶，仍主要是丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)。然而，在长期实践中临床医师和检验医学工作者均认识到，在诊断肝病上，ALT和AST的灵敏度尤其是特异性并不令人满意。鉴于此，寻找一种特异性和灵敏度更好的血清标志酶，准确反应肝细胞损伤，有其重要临床实用价值，也有其学术意义。 人体内的尿素几乎全部在肝细胞内生成，精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，ASL；EC4.3.2.1)是肝脏合成尿素重要酶之一。ASL主要分布在肝细胞浆中，小肠和肾组织含量少，而心、肺、脾等组织仅微量分布，肌肉组织几乎无此酶活性，故其肝细胞分布特异性较高，是一个很有希望成为反映肝细胞损伤的标志。还有研究表明，ASL是自身免疫性肝病中的一种新的自身抗原，其相应自身抗体是一种高度肝特异性自身抗体，不存在于肝外其他自身免疫性疾病患者的血清或体液中。由此可见，血清ASL可望成为肝细胞损伤的理想标志物。本研究从分离纯化(Separation and Purification，S&P)人肝组织ASL着手，分3部分较系统地对人ASL在组织器官中的分布特点、建立自动生化分析仪测定血清ASL速率法及方法学评价，以及临床诊断肝病的性能进行研究。 第一部分 目的:探讨ASL在人体内主要脏器及组织的分布特点，分离纯化肝细胞中ASL。 方法:制备入主要的器官或组织匀浆，分别测定各类匀浆中的ASL活性和蛋白浓度，计算其比活性(U/g蛋白)；离子交换层析法分离纯化肝细胞ASL，并以SDS-PAGE鉴定纯化产物。 结果:在研究的人体器官组织中，肝细胞ASL比活性最高(3.94 U/g蛋白)，肾脏次之，约为肝的1/10，脑、心、肠、胰、肺中有少量ASL活性，而其他组织、器官仅微量ASL存在。离子交换层析和透析纯化的产物，电泳仅见单一条带，其分子量约50 kD。 结论:证实了ASL在人体内主要存在于肝细胞内，有相对高的肝细胞分布特异性。 第二部分 目的:建立适用于自动生化分析仪的ASL活性速率测定法，并进行方法学评价。 方法:根据ASL催化的化学反应，以及自动生化分析仪工作特点，建立特异性的偶联酶促反应体系，以正交试验优化反应条件。按国际临床化学学会(IFCC)的有关文件，对建立的方法进行方法学评价，包括精密度、回收率、试剂稳定性、最低检测限、线性范围、干扰试验等。 结果:建立了一种新的基于酶偶联反应，以NAD<'+>-NADH为指示系统，可在全自动生化分析仪上测定血清ASL活性的动力学方法。确定了该法的最适底物浓度、pH、反应时间和反应温度等反应条件。方法学评价研究表明，本法的精密度：批内变异系数均值为4.0％(3.6％～7％)，批间变异系数均值为5.9％(4.0％～8.5％)，回收率是100.5％(93.3％～107.2％)，在0～167.7 U/L间有良好的线性范围，最低检测限为0 U/L。干扰试验提示：胆红素<342μmol/L不会，草酸钠、K<,2>EDTA、Na<,2>EDTA、柠檬酸钠、肝素锂和肝素钠抗凝剂在抗凝浓度内不会产生干扰，Hb>0.06g/L时产生明显干扰。试剂贮存于2～8℃，20周内稳定。 结论:成功建立了适用于自动生化分析仪完成的ASL活性速率测定法，该法具有检测速度快、线性范围较宽、样本用量小、特异性和敏感性较高，完全适合临床实验室应用的特点。 第三部分 目的:应用建立的ASL活性自动分析方法，探讨血清ASL活性测定对常见的各种肝病的临床诊断性能。 方法:对291例肝病患者，包括31例急性肝病患者、165例慢性肝病患者(慢性乙肝患者73例、慢性丙肝患者39例、酒精性肝炎患者25例、药物性肝炎患者16例和自身免疫性肝炎患者12例)、肝硬化患者67例、肝癌患者28例；排除了肝病的其他疾病患者247例，健康人32例，分别采集血样制备血清。测定血清ASL和传统的肝病酶学指标ALT、AST、GGT、LDH及ALP活性，以及TBil水平。慢性肝病组还测定了胱抑素C(cystatin C，CysC)和金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitors of metallloproteinases，TIMPs)浓度。肝病组中31例患者进行了肝脏病理组织学检查。按循证检验医学原则，对上述指标的诊断性能进行比较评价。对4例不同肝病患者进行了追踪观察。 结果:方差分析显示，非肝病疾病组ASL活性与对照组无显著改变(F=1.108，P=0.355)。而其他肝病酶学指标及总胆红素与对照组比较，均有显著差异(均P<0.05或P<0.01)。与健康对照相比较，ASL活性在各类肝病患者均有19倍以上的升高，活性范围与健康对照组完全无重叠；而ALT和AST除在急性肝炎组分别有25、19倍的升高外，其他肝病组仅有1.5～4倍增加，活性范围与健康对照组存在部分重叠。ASL升高的程度依次是肝癌>急性肝炎>肝硬化>慢性肝炎。慢性肝病组ASL活性与非肝病组及健康对照之间完全无重叠。但ALT和AST则有较大重叠。接收者操作特征曲线(ROC曲线)显示，ASL(以8 U/L为分界值)对诊断肝病总的敏感度为99.7％，特异性为97.8％；ALT和AST则分别为97.6％和33.3％，83.8％和36.5％。ROC曲线下面积(95％可信限)ASL为1.000(0.999～1.000、)；ALT和AST(均以40 U/L为分界值)则分别为0.755(0.716～0.793)和0.686(0.643～0.729)。对诊断慢性肝病，ASL的敏感度为99.4％，特异性为97.8％，曲线下面积约为1.00(0.999～1.000)；而ALT敏感度为63.6％，特异性为34.1％；AST敏感度为61.8％，特异性为37.3％。曲线下面积ALT和AST分别仅是0.556(0.498～0.631)和0.545(0.488～0.602)。与肝病理组织学检查结果相关性分析表明，ASL浓度(86.9±26.5)与炎症活动度计分(9.83±3.36)呈正相关(r=0.417，P=0.019)。Person相关分析显示，ASL与CysC和TIMPs在肝纤维化患者中均呈正相关。追踪观察发现，血清ASL活性的变化，与不同肝病的病理变化进程及病毒性肝炎的感染程度相关。 结论:血清 ASL活性是反映肝细胞损伤的特异、灵敏指标，对肝病的诊断性能明显优于传统的ALT、AST等肝病酶学指标。血清ASL活性测定有望成为肝病的诊断指标，在临床推广应用。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

第一部分人体内肝精氨酸代琥珀酸裂解酶的组织器官分布

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第二部分血清精氨酸代琥珀酸裂解酶测定速率法的建立与方法学评价

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第三部分血清精氨酸代琥珀酸裂解酶活性测定对肝病诊断性能的研究

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

文献综述：肝功能相关的血清酶学研究进展

致谢

博士期间发表和撰写的文章