心腔内超声辐照增加基因表达治疗犬心肌梗死

摘要

背景和目的：近年，国内外学者尝试用基因治疗恢复心肌梗死(MI)病人的血流灌注、改善预后。基因的转染表达是治疗关键，基因直接以裸露 DNA 的形式转移比病毒载体安全，但缺点是转染和表达效率低，难以达到治疗效果。研究发现，超声的生物物理效应可明显促进基因转染表达，但用传统的体外超声辐照心脏，因声窗等因素影响，最终到达心肌的声能量、辐照效果难以准确控制。另外，在基因治疗缺血性心脏病的临床运用中，需要建立安全简便的基因靶向导入方法。 针对基因治疗效应性、投递途径等存在的问题，本研究将基因治疗与介入超声结合，在介入导管顶端安装超声换能器，并配置投送基因的特制微型注射针，研制成超声导管：深入心腔内部经导管中微型针将基因注射到心肌局部，之后在心腔内发射超声近距离辐照心肌促进基因转染表达；实验中，我们也观察超声造影剂微泡(MB)携基因直接注射到心肌后的成像效果，探讨微泡携基因直接注射到心肌后协同心腔内超声辐照对基因表达的影响。 方法： 1、正常活体犬介入实验： 犬17只，分为5组(n=3-4)分别为：①绿色荧光蛋白裸质粒(EGFP)+MB+ 心腔内超声辐照组(US)，②EGFP+US，③EGFP+MB，④单纯EGFP注射组，⑤空白对照组 (注射等量生理盐水)。 在X线影像引导下，超声导管经左颈总动脉的9F血管鞘进入犬左心室腔，经微型针分5个点向心肌注入MB和/或EGFP的混合液，每个注射点注射量为100μL(含EGFP100ug)，EGFP/MB/US 及EGFP/US组在注射完毕后，即刻以超声导管在心腔内发射超声辐照每个注射点部位的心肌 1 分钟(4.3MHz/1.0 W/cm<'2>)，其他2组仅注射基因不行超声辐照。观察：①超声导管经皮心肌内注射、在心腔内辐照心肌的可行性及准确性；②MB结合基因注射到心肌后的成像效果、分布范围。术后48h：③检测心肌注射部位EGFP mRNA、蛋白表达；④探讨心腔内超声单独辐照以及协同心肌内注射 MB 对 EGFP 基因表达的影响；⑤观察心腔内超声辐照对心肌组织细胞的生物效应，评估超声导管的安全性；⑥探讨心腔内超声辐照增加EGFP在心肌表达的生物机制。 2、犬MI模型的介入实验： 采用冠状动脉结扎法建立犬MI的动物模型，分为5组(n=3-5)：①肝细胞生长因子裸质粒(HGF)+MB+US组，②HGF+US组，③单纯HGF治疗组，另设假手术组(Sham组)与MI无干预组。用上述注射方法，在HGF基因治疗组分5个点向心肌内注入MB和/或HGF混合液(每个点100μL，含HGF100ug)，HGF/MB/US、HGF/US两组注射后行心腔内超声辐照，单纯HGF治疗组仅注射 HGF 不行超声辐照，术后28天检测：①HGF的mRNA及蛋白在犬缺血心肌的表达；②心肌梗死面积、左右心室重量指数、心肌羟脯氨酸含量(HC)和心肌胶原容积分数(CVF)变化；③缺血心肌中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、CD31、血小板八因子的表达，计算微血管计数。 结果：① 研制的超声导管经常规介入法顺利进入犬左心室腔，向心肌内注射基因、在心腔内发射超声辐照心肌的实验过程中犬生命体征平稳，无严重并发症；②微泡携基因注射到心肌可在局部清晰显影，诊断超声可清楚观察微泡在心肌内的成像效果、分布层次和范围；③与单纯EGFP注射组比较，EGFP/MB/US组 EGFP 的mRNA表达增加约8倍，荧光强度增加约8.6倍(p<0.01)，EGFP/US 组EGFPmRNA表达增加约6倍，荧光强度增加约5.1倍(P<0.01)；单纯EGFP注射组与 EGFP/MB组的EGFP mRNA表达、荧光强度无统计学差异(P>0.05)；对照组无EGFP表达。④EGFP仅在注射部位心肌表达，其他脏器无EGFP沉积及表达，各实验组犬肝、肾、肺脏组织无异常病理改变；⑤心腔内超声辐照后心肌轻微充血，少量红细胞溢出；透射电镜提示心肌细胞及线粒体膜的通透性增加，心肌细胞浆内可见小空泡形成；心肌内直接注射微泡协同心腔内超声辐照后上述生物效应更明显；⑥心腔内超声辐照心肌后增加内源性VEGF及HSP70表达；VEGF及HSP70表达均以EGFP/MB/US组最明显，其次为EGFP/US组(P<0.01)，EGFP/MB组仅有少量VEGF及HSP70表达，3组间差异有统计学意义(P<0.01)；单纯EGFP注射组及对照组无VEGF、HSP70表达。⑦EGFP/MB/US组心肌中EGFPmRNA表达与VEGF及HSP70mRNA表达呈明显正相关，相关系数分别为0.76、0.75(P<0.05)；EGFP/US组心肌中EGFPmRNA表达也与VEGF及HSP70mRNA表达呈明显正相关，相关系数分别为0.75、0.77(P<0.05)；EGFP/MB组EGFPmRNA表达与VEGF、HSP70mRNA表达无相关性(P>0.05)。 在犬MI实验中：①心腔内超声辐照后增加HGFmRNA及蛋白在犬缺血心肌的表达；与单纯HGF治疗组比较，HGF/MB/US组HGF的mRNA表达增加约6倍，蛋白增加约4.7倍(P<0.01)；HGF/US组HGFmRNA及蛋白表达则分别增加约4倍、3.3倍(P<0.01)。②HGF基因治疗能上调心肌中CD31、VEGF的mRNA表达，增加犬MI后毛细血管新生，以HGF/MBUS组最明显(P<0.01)，其次为HGF/US组(P<0.01)，单纯HGF裸质粒注射组CD31、VEGF的mRNA表达及血管新生较MI组增加，但低于其他2个HGF治疗组(p<0.01)。③HGF基因治疗也降低左右心室重量指数、HC和Ⅰ型、Ⅲ型胶原的CVF，改善犬MI后心脏重塑；所有治疗效应均以HGF/MB/US组最明显。 结论：超声导管经皮介入向心肌内注射基因，在心腔内辐照心肌相对安全可行，可产生增加心肌生物膜及血管通透性等多种生物效应，并且明显增加外源性EGFP裸质粒在正常心肌、HGF 裸质粒在缺血心肌的表达；MB 携基因直接注射到心肌后，能够作为示踪剂显示基因在心肌内的分布，并与心腔内超声辐照协同进一步增加基因表达。心腔内超声辐照心肌增加基因表达可能与超声的空化、机械、热效应等综合作用有关；HGF基因干预对犬MI有部分治疗效应。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分心腔内超声辐照增加EGFP转染表达的实验

第一节超声导管经皮心肌内注射、心腔内辐照增加EGFP转染表达的可行性实验

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

第二节超声导管经皮心肌内注射、心腔内辐照增加基因转染表达的安全性评价

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

第三节心腔内超声辐照心肌增加EGFP裸质粒转染表达的机制探讨

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

第二部分心腔内超声辐照增加HGF转染表达治疗犬心肌梗死的实验

第一节超声导管经皮心肌内注射、心腔内辐照增加HGF在犬缺血心肌表达的实验

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

第二节心腔内超声辐照增加HGF表达治疗犬心肌梗死的效应观察

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

附图

参考文献

全文总结

综述：心腔内超声运用进展

致谢

攻读博士学位期间完成的论文及成果