Multiplex PCR-RLB检测常见性病病原体的实验研究

摘要

目的：建立和评价一个新的多重PCR-反向线点杂交技术(mPCR/RLB)检测常见性传播疾病(STD)病原体的方法。 方法： 1．利用http://www.angis.org.au网站，在NCBI的GenBank数据库中获得试验菌株沙眼衣原体(CT)隐蔽质粒基因、淋病奈瑟菌(NG)的16S rRNA和Opa基因、3种支原体(人型支原体(Mh)，解脲脲原体(Uu)，微小脲原体(Up))的16S-23S rDNA间隔序列和6种念珠菌(白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌)的5.8S-28S rDNA间隔序列的核苷核酸序列。分别设计CT和NG的特异性引物及检测探针。并用Pretty将6种念珠菌以及3种支原体的间隔序列分别进行比对，设计其相应属通用引物和各菌种的特异性寡核苷酸探针，使各引物及探针的Tm值等参数尽量一致。 2．建立PCR/RLB检测6种常见念珠菌，对其进行方法学评价(包括特异性、敏感性等)，并与涂片法、培养法鉴定结果(Merieux Vitek)进行比较。 3．建立mPCR/RLB同时检测CT、NG、Uu、Up和Mh等5种性病病原菌，并与荧光定量PCR(FQ-PCR)和支原体液体培养法进行比较。 结果： 1．PCR/RLB检测上述6种念珠菌的敏感性为10 CFU/ml。通过对100株念珠菌分离株的检测，与培养法(Merieux Vitek)比较表明，有97株与培养法鉴定结果一致，另外3株通过DNA测序证实与PCR/RLB检测结果一致。通过对200例女性阴道试子标本进行检测，PCRfRLB的阳性率为49％，而涂片法和培养法的阳性率分别为27％和39％，明显高于涂片法和培养法(P<0.05)。 2．mPCR可同时扩增CT、NG、Uu、Up和Mh标准菌株DNA，其PCR产物的片段长度为208bp～414bp。97份FQ-PCR CT阳性标本中有93份经mPCR/RLB检测为CT阳性，45份FQ-PCR CT阴性标本中35份mPCR/RLB阴性。41份FQ-PCR NG阳性标本中34份mPCR/RLB NG阳性，101份FQ-PCRNG阴性标本中98份mPCR-RLB阴性。其中36份经mPCR/RLB检测为两重以上混合感染。32份支原体液体培养阳性标本中28份mPCR/RLB阳性，13份支原体培养阴性标本经mPCR/RLB检测均为阴性。 结论：成功建立了Multiplex PCR/RLB快速、同时检测常见性传播疾病病原体的新方法，为其临床应用奠定了基础。

目录

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

摘要

前言

第一部分：各病原体特异性或通用引物、特异性探针的设计及靶基因的确定

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分：PCR-RLB检测临床常见念珠菌的方法学建立及初步应用

1材料与方法

2结果

3讨论

第三部分：Multiplex PCR-RLB同时检测CT，NG，Mycoplasmas的方法学建立及初步应用

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述 沙眼衣原体的分子生物学诊断研究进展

致谢

研究生期间发表的文章及学术活动