IRAK-M基因多态性与脓毒症易感性的相关性研究

摘要

脓毒症(sepsis)是临床危重患者最主要的死因之一，其死亡率高达30-40％。美国疾病控制中心 (CDC)统计资料显示，每年约有75万例脓毒症患者，其中约21万例死亡。在临床上，脓毒症主要由G<'->细菌引起，在脓毒症感染中占60％以上，而起主要致病作用的内毒素，又名脂多糖(lipoposaccharides，LPS)，是G<'->细菌的主要成分，可被先天性免疫系统的模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)所识别，从而引起宿主对LPS的反应。LPS通过激活单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagocytic system，MPS)引起白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素(IFN)等大量前炎性介质的释放，从而导致全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)及脓毒症的发生，进而造成多器官功能不全综合症(multiple organs dysfunction syndrome，MODS)，甚至死亡。 近几十年来，虽然对危重脓毒症患者进行积极监护和有效的支持治疗，脓毒症患者的病死率仍然居高不下。几个大宗临床实验研究显示，抗炎治疗并未能预期降低脓毒症患者死亡率。危重症监护(ICU)医师注意到，危重患者脓毒症的易感性存在高度的个体差异，而且，对相似的治疗，不同患者反应和预后可能完全不同。随着人类基因组计划研究的完成，越来越多的研究证实，人类基因多态性与疾病易感性之间有着密切的关系。所谓基因多态性是指在一随机婚配的群体中，染色体同一基因座位点上有两种或两种以上的基因型，它是决定人体对疾病易感性、临床表现多样性及药物治疗反应差异性的重要因素。目前有关基因多态性与脓毒症的关系研究提示，基因多态性与脓毒症有密切的关系，基因多态性与脓毒症的易感性、转归等均有着密切的关系，某些与脓毒症相关的特异性基因或基因表达变异将直接影响宿主对脓毒症的易感性及其预后。基因多态性与脓毒症易感性的关系的研究对于从基因水平上揭示脓毒症的发病机制和患者临床表现多样性的物质基础具有重要意义。最近的研究表明，白介素1受体相关激酶M(IRAK-M)在LPS信号传导中起负性调节作用，可以减轻人体对LPS引起的脓毒症的炎性反应。但目前大多数的研究主要集中于IRAK-M与内毒素耐受方面的关系的研究，IRAK-M基因多态性与疾病易感性的关系的研究较少。NaKa等研究发现，IRAK-M基因多态位点的多态性与临床哮喘的发生没有明显的关系，Lammers等研究发现IRAK-M+22148G>A多态位点基因多态性与慢性复发性结肠炎的易感性有关。目前关于IRAK-M基因多态性与脓毒症易感性的关系尚未见报道。本研究通过检测临床脓毒症患者IRAK-M+22148G>A多态位点的基因型及血浆中炎症介质的表达情况，进一步探讨IRAK-M基因多态性与脓毒症易感性的关系，为更加科学地认识脓毒症的发病机制，脓毒症的早期诊断和预后判定提供依据，以及基因治疗靶点的选择提供新的思路。 目的：从分子生物学水平检测白介素1相关受体M(IRAK-M)的基因表达及+22148G>A多态位点基因的多态性，分析IRAK-M基因多态性对炎症介质TNF-α、IL-6等表达的影响，探讨IRAK-M基因多态性与临床脓毒症易感性的关系。 方法：选择重庆市九院及我院2005年4月至2006年10月期间，依据2003年国际脓毒症定义讨论公报定义的脓毒症诊断标准，临床确诊为脓毒症的患者82例为实验组，同期门诊的健康体检人群118例为对照组。(1)采用DNA提取试剂盒提取所有研究对象的DNA，应用聚合酶链反应法(Polymerase chain reaction，PCR)对目的基因进行扩增，并基因测序鉴定，确定为IRAK-M的目的基因片断；(2)应用限制性片断长度多态性分析法(Restrict fragment length polymorphisms，RFLP)对PCR产物进行酶切，Doe Gel 2000凝胶图像分析系统成像分析，根据不同的酶切片断，分析其基因型的分布情况及等位基因的分布频率；(3)应用ELISA法检测其血浆中炎症介质TNF-α和IL-6的表达情况，分析不同基因型与炎症介质的表达情况之间的关系；(4)两组间基因型结果比较用x<'2>检验，ELISA结果数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数的比较用t检验。所有数据分析采用SPSS13.0软件，P<0.05表示有统计学意义。携带某基因的疾病易感性用OR值估计其相对危险度，并计算其95％可信区间。 结果：1、聚合酶链反应(PCR)分析结果表明：脓毒症患者及健康对照组的基因组中均有IRAK-M基因的表达；2、限制性片断长度多态性分析法(RFLP)分析结果表明：酶切后片断存在3种基因型：A/A型、G/G型和G/A型。健康对照组中IRAK-M+22148G>A位点中A/A基因频率为61.0％，G/G基因频率为28.8％，A/G基因频率为10.2％，G等位基因频率为33.9％，A等位基因频率为66.1％；在脓毒症组中G/G基因频率为81.7％，明显高于对照组28.8％，A/A基因频率为13.4％，明显低于对照组61.0％，两组间基因型比较有显著差异(P<0.0001)，G 等位基因频率为84.1％明显高于对照组33.9％，A 等位基因频率为15.9％，明显低于对照组66.1％，两组间比较有显著差异(P<0.0001)。3、ELISA结果显示：脓毒症组TNF-α水平(843±97.34pg/ml)明显高于对照组水平(287±79.12pg/ml)，两组间比较有显著差异(P<0.05)，相应的IL-6水平(741±65.61pg/ml)明显高于对照组水平(194±58.47pg/ml)，两组间比较有显著差异(P<0.05)；脓毒症组中G/G基因型患者TNF-α水平(967±107.45pg/ml)明显高于G/A基因型(384±89.13pg/ml)和 A/A基因型的患者水平(116±76.32pg/ml)，基因型间比较有显著差异(P<0.05)，相应的IL-6水平(821±103.43pg/ml)亦明显高于G/A基因型(321±81.34pg/ml)和A/A基因型的患者水平(97±46.52pg/ml)，基因型间比较有显著差异(P<0.05)。4、分析显示，G/G基因型OR=11.03>1，A/A基因型OR=0.09<1，两者的基因型与脓毒症之间存在统计学联系，携带G/G基因型的人群比其它基因型的人群明显易患脓毒症，其易感性比其它基因型高11.03倍，A/A基因型对脓毒症的感染具有保护作用。 结论： 1、IRAK-M+22148G>A位点存在基因多态性。 2、IRAK-M+22148G>A基因多态性与脓毒症的易感性相关，G/G基因型者易患脓毒症，A/A基因型对脓毒症的感染具有保护作用。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

1材料和方法

2结果

讨论

结论

参考文献

附图

文献综述：库普弗细胞在内毒素血症致肝损伤中的作用

致谢

攻读硕士学位期间发表的综述、论文及参与的科研课题