谷氨酰胺强化的早期肠内营养对肝移植大鼠肠粘膜屏障保护作用的研究

摘要

目的:本研究在成功建立大鼠原位肝移植模型的基础上，围手术期早期应用Gln强化的肠内营养混悬液能全力进行肠内营养，通过检测反映肠粘膜屏障状况的相关指标的动态变化，从免疫学、分子生物学和微生态学等领域系统探讨肝移植肠粘膜屏障的损伤状况以及Gln强化的EEN能否对肝移植肠粘膜损伤具有保护作用，为减轻肝移植肠道损伤，减少肝移植并发症，提高其存活率采取有效措施提供动物实验依据，具有重要的临床意义。 方法:健康雄性Wistar大鼠，随机分为正常对照组 (Control组)、原位肝移植组(OLT组)和原位肝移植+Gin强化的早期肠内营养组(EEN组)。以未经任何处理的大鼠为正常对照组；EEN 组受体术前第 3d、第2d、第1d及术后3h开始给予肠内营养混悬液能全力(125ml/d/kg)+谷氨酰胺(0.3g/d/kg)灌胃，均匀分 6 次给予，期间自由饮水，直至动物处死为止。OLT 组受体于相应时间点按同样方法给予等容积的生理盐水。以未经任何处理的大鼠为供体，两袖套法建立大鼠原位肝移植模型。按肝移植后12h、24h和72h分为三个亚组。于每个时间点采集血液和组织标本。用Limulus Amebocyte Lysate(LAL)Pyrochrome Kit，采用终点法检测门静脉血浆内毒素水平；酶学分光光度法检测门静脉血浆 D-乳酸含量；酶联免疫吸附法(ELISA)测定下腔静脉血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量；光镜及电镜检查回肠粘膜的病理改变情况；硫代巴比妥酸法测定肠粘膜丙二醛(MDA)含量；放射免疫测定肠组织中分泌型免疫球蛋白 A (slgA)含量；取门静脉血，肠系膜淋巴结(MLN)、肝、脾组织作细菌培养；免疫组织化学法检测肠粘膜NF-κB、ICAM-1的表达；荧光定量 PCR 和 Western blotting 检测肠组织TNF-αmRNA 和TNF-α蛋白表达水平。 结果: (1)肝移植后12h、24h和72h，OLT组内毒素水平分别为0.427±0.092，0.907±0.057 和 0.803±0.052EU/ml，EEN 组分别为0.413±0.056，0.617±0.049和0.406±0.043EU/ml，均明显高于正常对照组0.109±0.017 EU/ml (P<0.01)；EEN组24h、72h分别与OLT组24h、72h比较，有显著性差异(P<0.01)，分别下降32.0％、49.4％。 (2)肝移植后12h、24h和72h，OLT组D-乳酸含量分别为1.23±0.12，2.30±0.12和1.92±0.11μg/ml，EEN 组分别为1.22±0.11，1.78±0.10 和1.23±0.08μg/ml，均明显高于正常对照组0.48±0.07μg/ml(P<0.01)；EEN组24h、72h分别与OLT组24h、72h比较，有显著性差异(P<0.01)，分别下降22.6％、35.9％。 (3)肝移植后12h、24h和72h，OLT组血清TNF-α含量分别为107.06±7.47，759.04±24.1 4 和 569.17±26.70pg/ml，EEN组分别为102.28±9.61，715.50±25.73和521.13±20.86pg/ml，均明显高于正常对照组15.98±2.07 pg/ml(P<0.01)；EEN组24h、72h低于OLT组24h、72h，有显著性差异(P<0.01)，分别下降5.74％、8.44％。 (4)肝移植后12h、24h和72h，光镜下见OLT组回肠粘膜弥漫性重度糜烂、坏死脱落，绒毛间隙增宽，固有层水肿，大量炎性细胞浸润，粘膜变薄，以24h最重；而EEN组轻度糜烂，灶性坏死、只有轻度水肿和少量炎性细胞浸润；OLT组绒毛长度分别为276.5±16.9，152.1±11.3和199.3±11.6μm，EEN 组分别为283.9±15.7，228.1±14.9 和289.9±10.8μm，均明显低于正常对照组383.3±14.1μm(P<0.01)；但EEN组24h、72h明显高于OLT组(P<0.01)，分别是后者的1.50、1.45倍。透射电镜下见OLT组24h肠粘膜上皮细胞间隙增宽、细胞溶解，微绒毛坏死、脱落，而EEN组上皮细胞间隙基本正常、线粒体轻度肿胀、微绒毛轻度空泡化和局部坏死脱落。 (5)肝移植后12h、24h和72h，OLT组肠粘膜MDA含量分别为 18.95±1.33，37.13μ±1.46 和31.30±1.12nmol/mg.prot，EEN 组分别为17.91±1.12，24.88±1.10 和19.40±0.91nmol/mg.prot，均明显高于正常对照组8.21±0.61nmol/mg.prot(P<0.01)；EEN组12h、24h和72h分别与OLT组12h、24h和72h比较，有显著性差异(P<0.01)，分别下降5.5％、33.0％、38.0％。 (6)肝移植后12h、24h、72h，OLT组肠粘膜Slga含量分别为0.733±0.036，0.546±0.042 和 0.580±0.037μg/ml，EEN组分别为0.755±0.039，0.722±0.029和0.905±0.030μg/ml，除了EEN组72h与正常对照组无显著性差异外，其余各组明显低于正常对照组0.887±0.045μg/ml(P<0.01)；EEN 组 24h、72h分别与OLT组24h、72h比较，有显著性差异(P<0.01)，分别是后者的1.32、1.56倍。 (7)肝移植后12h、24h和72h，OLT 组肠道细菌脏器移位率分别为52.50％、82.50％和72.50％，EEN组分别为47.50％、45.00％和32.50％，均明显高于正常对照组5.00％(P<0.00227)，EEN组24h、72h明显低于OLT组24h、72h(P<0.00227)，分别下降了45.5％、55.2％。 (8)免疫组织化学结果显示：肝移植后12h、24h和72h，OLT组肠组织NF-κB表达光密度值分别为0.1494±0.0167、0.2018±0.0139和0.1623±0.0142，EEN 组分别为0.1119±0.0091、0.1437±0.0102和0.1087±0.0109，均明显高于正常对照组0.0606±0.0147(P<0.01)；肝移植后12h、24h和72h，OLT组肠组织ICAM-1表达光密度值分别为0.1380±0.0136、0.1750±0.0086 和 0.1604±0.0077，EEN组分别为0.1097±0.0064、0.1289±0.0075和0.1086±0.0050，均明显高于正常对照组0.0464±0.0053(P<0.01)；NF-κB主要表达于表面上皮和隐窝上皮细胞，亦表达于血管内皮细胞；ICAM-1主要表达于上皮细胞或小血管内皮细胞；EEN组12h、24h和72h NF-κB、ICAM-1表达明显低于OLT组12h、24h和72h(P<0.01)。 (9)荧光定量PCR结果表明：肝移植后12h、24h和72h，OLT组肠组织TNF.amRNA表达分别为4.20±0.23，9.40±0.19，5.43±0.27×10<'4>copies/μgRNA，EEN 组分别为3.01±0.10，5.54±0.19，2.61±0.14×10<'4>copies/μgRNA，均明显高于正常对照组(P<0.01)；但EEN组12h、24h和72h TNF.amRNA表达明显低于OLT组12h、24h和72h(P<0.01)，分别下降28.3％、41.1％、51.9％。 (10)Western blotting 结果表明：肝移植后12h、24h和72h均可检测到TNF-α蛋白表达，但EEN组表达强度明显减弱；半定量分析结果：OLT组TNF-α蛋白分别为1.75，3.40，2.79，EEN组分别为1.32，2.08，1.36，EEN组与OLT组相比分别下降24.6％、38.8％、51.3％。 结论: (1)原位肝移植无肝期导致肠淤血和肠缺血再灌注损伤，引起肠粘膜上皮细胞脂质过氧化反应，肠粘膜MDA含量增加、SIgA水平降低，同时激活肠粘膜巨噬细胞NF-κB活性，产生TNF-α、ICAM-1等细胞因子，使肠粘膜屏障功能受到严重损害，表现在以下几个方面：①机械屏障受损：上皮细胞肿胀，细胞间隙增宽，绒毛坏死脱落，萎缩变短；②生物屏障和免疫屏障受损：表现为细菌和内毒素移位；③肠通透性增加，血D-乳酸含量升高。 (2)Gln 强化的 EEN 能改善肝移植大鼠肠粘膜血供，降低肠粘膜MDA 的产生，有助于肠道细胞正常分泌SIgA，抑制肠粘膜巨噬细胞NF-κB活性，减少TNF-α、ICAM-1等细胞因子的产生，从而改善肝移植肠粘膜损伤情况，明显抑制细菌和内毒素的移位。但其更多机制仍有待进一步研究和探讨。根据以上实验结果，我们推测对于临床肝移植病人，围手术期早期运用 Gln 强化的肠内营养，能减少肠源性感染的发生，对提高肝移植存活率具有重要的意义。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

全文总结

附图

文献综述：肝缺血再灌注对肠道损伤及细菌移位的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文