当归多糖对造血细胞抗冷冻损伤及冷冻损伤的可恢复性研究

摘要

当归作为祖国传统医学的“补血、活血”要药已有数千年的临床应用历史。现代实验研究证明：当归化学成分复杂，当归多糖(APS)是其主要化学成份之一。APS是当归中促进造血的有效成分，对正常或贫血小鼠的髓系造血祖细胞(BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-MK)的增殖分化有显著的促进作用；同时APS在体外可促进人红系、粒单系及混合系造血祖细胞的增殖分化；另外，在有外源性造血生长因子(HGF)存在的条件下，APS可促进脐血单个核细胞(MNC)总数，CFU-GM，CFU-E集落数量增多，且可使脐血单个核细胞形成大量基质细胞贴壁。但目前尚未见APS对造血细胞抗冷冻损伤及冷冻损伤的可恢复性研究的报道。 造血干细胞移植(HSCT)是将从骨髓、外周血、脐血中分离的造血干细胞(HSC)移植给受者，从而重建或恢复受者的造血和免疫功能，现已成为治疗恶性血液病和多种实体瘤的有效方法。脐血(umbilicalcord blood,UCB)是继骨髓及外周血之后又一新的}tSC移植供源，因具有HSC含量高，增殖能力强，免疫原性弱等特点已被应用于临床，但单份脐血HSC含量有限，只能用于低体重小儿移植。为更广泛地开展脐血HSCT及建立脐血库，需长期低温保存脐血造血细胞。如何在体外将脐血造血细胞进行有效的保存与复苏，降低其冷冻损伤，是HSCT治疗的关键技术环节之一。造血细胞受到冷冻、解冻过程的损伤，活力会有一定程度下降，但在适当条件下，可使造血细胞活力得到最大程度的保存。除冷冻保护剂和适当的降温速度、复温过程外，目前已发现某些HGF对提高冷冻的造血细胞增殖潜力有一定作用。但其价格较昂贵。研究发现：人参总皂苷能促进冷冻骨髓造血细胞的复苏、增殖，提高骨髓细胞冷冻损伤的可恢复性。许多植物多糖尤其是中药多糖对血细胞发生有明显促进作用，其是否可以提高冷冻的HSC增殖潜力值得深入探讨。 本研究以健康产妇，足月分娩且无并发症的脐血为标本，分为两个部分进行实验研究：1.APS对脐血造血细胞抗冷冻损伤的作用；2.APS对脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性与HGF联合促进冷冻复苏后脐血造血细胞体外扩增的效应进行研究。本研究旨在为APS在造血细胞冷冻保护中的应用提供实验依据。 一、APS对脐血造血细胞抗冷冻损伤的作用研究 目的：探讨APS在脐血造血细胞冷冻前的抗冷冻损伤作用。 方法： 1.用淋巴细胞分离液(Fieoll)密度梯度离心法，明胶法，羟乙基淀粉(HES)法分离脐血MNC，分离前后计数MNC数，通过计算MNC的得率比较三种分离方法的效率，从而选择一种快速有效的分离方法。2.将脐血MNC以5％的二甲基亚砜(DMSO)为冷冻保护剂在液氮中分别冻存1、3.6个月，采用细胞计数法，台盼蓝拒染实验，造血祖细胞体外半固体培养，流式细胞术等技术方法，通过比较台盼蓝拒染率，MNC、CFU-Mix、CD34<'+>细胞回收率了解冻存不同时间对脐血MNC和造血细胞活性的影响。3、将分离得到的MNC随机分为5组：APS50μg/ml组、APS100μg/ml组、APS200μg/ml组、APS400μg/ml组和对照组。分别加入不同浓度的APS或等量的培养液培养24小时，采用细胞计数法计数培养前、后各组的MNC数，了解APS能否促进MNC的增殖。4.将以上各组培养24h后的脐血MNC以5％的DMSO作为冷冻保护剂，在液氮中保存1个月后取出复苏。采用细胞计数法，台盼蓝拒染实验，造血祖细胞体外半固体培养，流式细胞术等技术方法，通过研究各组冻存前后MNC、CFU-Mix、CD<,34><'+>细胞回收率及台盼蓝拒染率，了解APS在冷冻前作用于脐血造血细胞，是否能增强脐血造血细胞耐受冷冻的能力。 结果：1.三种分离方法中HES组和明胶组的MNC得率明显高于Ficoll组(P<0.05)，HES组和明胶组的MNC得率无统计学差异(P>0.05)。2.脐血MNC冻存1，3，6个月，比较冻存前后MNC、CFU-Mix、CD34<'+>细胞回收率及台盼蓝拒染率显示差异均无显著性(P>0.05)。3.APS100μg/ml组和APS200μg/ml组的脐血MNC的增殖倍数明显高于对照组(P<0.05)。4.APS100μg/ml组和APS200μg/ml组的MNC和CFU-Mix回收率较对照组均明显增高(P<0.05)； APS50μg/ml组、APS100μg/ml组和APS 200μg/ml组的台盼蓝拒染率较对照组明显增高(P<0.05)：APS100μg/ml组的以上指标均显示效果最佳；APS各浓度组和对照组比较，CD34<'+>细胞回收率差异无显著性(P>0.05)。 结论：1.HES法和明胶法分离脐血MNC的效率高于Ficoll密度梯度离心法。2.脐血MNC经过冻存和复苏，细胞有一定的损伤，但这种损伤并不与冻存时间成正比。3.APS能促进脐血MNC的增殖。4.APS能增强脐血造血细胞抗冷冻损伤的能力。 二、APS对脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究 目的：探讨APS是否具有恢复脐血造血细胞冷冻损伤的作用及与HGF联合促进冷冻复苏后脐血造血细胞体外扩增的效应。 方法：1.将复苏后的脐血MNC随机分为5组：APS50μg/ml组、APS100μg/ml组、APS200μg/ml组、APS400μg/ml组和对照组。复苏后立即加入不同浓度的APS，对照组加入等量培养液共同培养24h，采用MNC计数，台盼蓝拒染实验，造血祖细胞体外半固体培养，MTT比色分析法以及流式细胞术等方法检测APS对脐血造血细胞冷冻损伤的恢复性作用。2.冷冻复苏后将脐血MNC与HGF组合和不同浓度的APS(50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)共培养14天，计数MNC总数、CFU-Mix数以及用流式细胞仪检测扩增后CD34<'+>细胞率。 结果：1.APS 100μg/ml组和200μg/ml组较对照组脐血MNC数量与台盼蓝拒染率均明显增加，脐血造血细胞的增殖能力显著提高，CFU-Mix集落产率也明显提高(P<0.05)，APS 100μg/ml组的各个指标均显示效果最佳；APS 100μg/ml组的脐血MNC中CD34<'+>细胞率明显高于对照组(P<0.05)。2.与对照组相比，APS浓度为100μg/ml和200μg/ml联合HGF组可显著提高冷冻复苏后的脐血MNC数，CFU-Mix集落产率和CD34<'+>细胞率(P<0.05)。 结论：1.APS能提高冷冻复苏后脐血MNC和造血细胞的数量、活力以及增殖能力，可促进脐血造血细胞冷冻损伤的恢复。2.APS与HGF联合可促进冷冻复苏后的脐血造血细胞体外扩增。

目录

论文说明：符号说明

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摘要

第一部分 当归多糖对脐血造血细胞抗冷冻损伤的作用研究

前言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

5参考文献

第二部分 当归多糖对脐血造血细胞冷冻损伤的可恢复性研究

前言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

5参考文献

全文结论

文献综述 G-CSF对造血干/祖细胞动员机制的研究进展

硕士期间发表的文章

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