中性粒细胞弹力酶对呼吸道黏蛋白5AC基因表达及其转录调控的影响

摘要

目的：黏液高分泌和中性粒细胞聚集是气道慢性炎症性疾病的重要病理特征，前者导致黏液潴留从而引起并加重病变气道的阻塞，同时为细菌定植气道提供良好的培养基；而后者可释放多种促分泌因子加剧前述过程。目前认为具有组织溶解性的中性粒细胞弹力酶(neutrophilelastase，NE)可强烈诱导黏液主要组成成分黏蛋白(MIJC)表达增加，而MUC5AC作为炎症气道粘蛋白的主要特征性表型，决定着高分泌黏液的病理特性。研究发现MUC5AC的异常表达可被多种体内的炎症介质和细胞外因素等所诱导，而各种因素诱发MUC5AC表达增加的机制最终被定位在MUC5AC基因的转录增强导致MUC5AC蛋白的合成增加。近年来，有关MUC5AC基因表达机制的研究已经开展，但其确切机制尚未阐明。本研究通过探讨NE对人气道上皮细胞来源的肺腺癌细胞株A549细胞MUC5AC产生和mRNA表达的影响，以及MUC5AC基因5’上游序列的调控元件在该基因转录调控中的作用，从而进一步阐明NE在气道慢性炎症性疾病黏液高分泌中的分子机制，并为能从基因和分子水平寻找有效的防治措施提供实验资料。 方法：MUC5AC在A549细胞中的表达：体外培养A549细胞，加入不同浓度NE作用不同时间。采用酶联免疫吸附法(ELISA)在蛋白质水平检测培养上清液中MIC5AC蛋白含量；以RT-PCR的方法半定量测定A549细胞MIC5AC mRNA表达水平。 设计、构建MUC5AC基因5，上游序列系列截短的荧光素酶报告基因表达质粒：根据MUC5AC基因5’调控区的DNA序列及表达载体pGL3质粒的结构特点及实验需要设计PCR扩增引物。从人的基因组总DNA分离出MUC5AC基因5’非编码区大小为1300bp的启动子片段，并以此为模板对其进行5’端删除分析。MUC5AC基因5’上游序列系列截短的荧光素酶报告基因表达质粒经酶切和DNA测序鉴定证实构建成功后，用脂质体将报告基因质粒和内参照质粒共转染A549细胞，连续培养24h后加NE(浓度为100 nM)处理，孵育24h收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定报告基因的表达水平。 运用序列分析法和聚合酶链反应对构建质粒上的两个顺式调控元件分别进行定点突变：应用序列分析法确定据转录起始点约80bp和220bp分别含有顺式作用元件SP-1序列GGCCCCGCCC和NF-кB序列GGGGAGGACCCCT，设计两对导入定点突变引物，采用定点突变技术分别构建Sp-1及NF-кB位点的单独突变体，含人MUC5AC基因顺式调控元件定点突变序列荧光素酶报告基因质粒经酶切和DNA测序鉴定证实构建成功后，用脂质体将报告基因质粒和内参照质粒共转染A549细胞，连续培养24h后加NE(浓度为100 nM)处理，孵育24小时收集细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统测定报告基因的表达水平。 结果： 1、用ELISA法检测A549细胞培养上清液中MUC5AC蛋白的表达，10、50、100nMNE处理A549细胞5、10、30min，相同时间点不同浓度NE组MUC5AC蛋白表达水平分别与对照组比较差异均有统计学意义(t=3.406～20.909，P均<0.05)，且呈时间、剂量依赖的趋势(P<0.01)。用RT-PCR的方法检测MUC5AC mRNA表达，100 nM NE处理30min后A549细胞MUC5ACmRNA相对表达量明显高于对照组(t=10.299，P<0.01)。 2、成功构建了4种含有MUC5AC基因启动子序列系列截短的荧光素酶报告基因质粒，用真核细胞转染技术分别将四种含人MUC5AC基因启动子序列系列截短的报告基因质粒导入A549细胞，然后用NE刺激转染的A549细胞，观察到NE可分别诱导含有启动子序列-1330bp(PGL3E-1330/+48)(P<0.05)， -689bp(PGL3E-689/+48)(P<0.05)，-324bp(pG13E-324/+48)(P<0.05)的荧光素酶基因表达，而NE不能诱导pGL3E-MUC5AC-64/+48表达荧光素酶活性(P>0.05)。 3、MUC5AC基因启动子中的顺式作用元件下游NF-кB结合位点和SP-1结合位点分别位于-220bp和-80bp附近。将两种分别含有NF-кB结合位点和SP-1结合位点发生定点突变序列的报告基因质粒转染A549细胞并用NE诱导，观察到NE可促使含有MUC5AC启动子中NF-кB结合位点发生定点突变序列的报告基因质粒表达荧光素酶，而含有SP-1结合位点发生定点突变序列的报告基因质粒对NE诱导无明显反应。 结论： 1、NE可诱导A549细胞MUC5AC产生及其mRNA表达，且呈时间和剂量依赖的趋势，表明NE在基因转录水平诱导MUC5AC表达。 2、成功地构建了四种含人MUC5AC基因系列截短的启动子序列和两种含顺式作用元件发生定点突变序列的荧光素酶报告基因质粒，为研究NE及其他因素诱导MUC5AC基因表达的转录调控机制奠定了基础。 3、NE可分别诱导含有MUC5AC启动子-1330/+48、-689/+48、-324/+48序列的报告基因质粒表达荧光素酶，而含有-64/+48序列的报告基因质粒对NE诱导无反应，表明NE诱导MUC5AC基因表达依赖于启动子中-324bp和-64bp之间的序列。 4、NE可促使MUC5AC启动子-324bp至-64bp序列中NF-кB结合位点发生定点突变序列的报告基因质粒表达荧光素酶，而含有SP-1结合位点发生定点突变序列的报告基因质粒对NE诱导无明显反应，提示NE诱导MUC5AC基因表达主要依赖于其启动子中的顺式作用元件SP-1结合位点。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

研究背景

第一部分NE对A549细胞MUC5AC蛋白及mRNA表达的影响

前言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4小结

参考文献

第二部分MUC5AC基因启动子系列截短荧光素酶报告基因表达质粒的构建及其转录激活活性研究

前言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4 小结

参考文献

第三部分MUC5AC基因启动子顺式调控元件定点突变荧光素酶报告基因质粒的构建和MUC5AC基因表达的转录调控机制研究

前言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述一 慢性气道炎症黏液高分泌的分子机制

文献综述二 气道黏液高分泌物理医学疗法及其研究进展

致谢

攻读学位期间发表论文