复元胶囊对实验性骨关节炎的软骨保护作用研究

摘要

目的： 观察中药复方制剂-复元胶囊(简称FYC)对兔膝骨关节炎(OA)模型关节软骨的组织形态学及MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、IL-1β、TGF-β2表达的影响；研究FYC含药血清对软骨细胞增殖和P38信号通路的干预作用，探讨FYC对骨关节炎软骨退变的防治作用及可能的作用机理。 方法： 1．选用健康新西兰大白兔66只，用改良Hulth法制备兔膝骨关节炎模型，以FYC灌胃为干预治疗手段，观察各组股骨内髁关节软骨大体、光镜和电镜下的病理变化。采用免疫组化法检测退变膝关节软骨MMP-13、TIMP-2、IL-1β及TGF-β2的蛋白质水平，RT-PCR法检测MMP-13、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达。从骨关节炎软骨的破坏因素和保护因素，从mRNA转录水平到蛋白质表达水平，多层次、多角度观察FYC对骨关节炎软骨退变的影响。 2．选用健康21-28d龄SD大鼠，用酶消化法原代培养软骨细胞，给予不同浓度的FYC含药血清(0％、5％、10％、20％)刺激第3代软骨细胞，作用时间分别为24h、48h、72h，采用MTT法检测FYC含药血清对软骨细胞的增殖，根据OD值选择FYC含药血清的最佳作用浓度和最佳作用时间纳入后续试验。细胞化学免疫法检测Ⅱ型胶原表达以鉴定软骨细胞。采用Western blot法研究FYC含药血清对软骨细胞中p-p38和MMP-13表达的干预作用，从信号通路的途径，探讨 FYC防治骨关节炎软骨退变的可能作用机制。 结果： 1．FYC对兔膝OA组织形态学的影响 正常组股骨髁关节软骨光滑如常，改良Hulth术后4W时出现股骨内髁软骨面糜烂，骨赘形成，软骨细胞器肿胀或破裂，核染色质凝集等一系列OA的病理改变。术后8、12W时上述病理改变随造模时间的延长而加重，大体评分和Mankin’s评分与正常组比较有显著差异(p<0.05)。12W时FYC中、高剂量组能明显抑制兔膝OA的软骨退变，低剂量组以及4、8W时中、高剂量组均不能阻止软骨形态学改变。 2．FYC对兔膝OA软骨中MMP-13、TIMP-2、IL-1β和TGF-β2的影响 免疫组化显示：模型组全层软骨胞浆中均有MMP-13表达，染色呈深棕色，4W时模型组MMP-13比正常组明显升高，两组间有显著差异(p<0.01)。模型组8W时与4W时比较反而有所下降。8、12W时FYC中、高剂量组阳性细胞数目少，浅染，细胞分数与模型组比较有显著差异(p<0.01)。 4、8、12W时FYC高剂量组TIMP-2阳性细胞数比模型组多，染色深，其细胞分数与模型组比较有显著差异(p<0.05)。8W时FYC中剂量组细胞分数与模型组比较有显著差异(p<0.05)。 4、8、12W时模型组全层软骨胞浆中均有IL-1β表达，为深棕褐色。4W时FYC低、中、高剂量组IL-1β细胞分数均低于模型组(p<0.05)，组间无明显差异；8W时FYC中、高剂量组IL-1β细胞分数均低于模型组，与模型组比较皆有统计学意义(P<0.05)；12W时FYC中、高剂量组与模型组比较有显著差异(p<0.01)，并随剂量增加而显著下降。 正常组全层软骨细胞胞浆中均有TGF-β2阳性表达。4W时模型组关节软骨阳性细胞减少，12W时阳性细胞更少，4、8、12W时模型组与正常组间比较有显著差异(P<0.05)。4W时FYC中、高剂量组的表达同低剂量组比较，无明显差异(p>0.05)；8、12W时FYC中、高剂量组TGF-β2的细胞分数与模型组比较有显著差异(P<0.05)。 3．FYC对兔膝OA软骨中MMP-13、TIMP-1、TIMP-2mRNA表达的影响 4W时正常组关节软骨MMP-13mRNA中等量表达(0.98±0.23)，随时间延长变化不大。4W时模型组MMP-13mRNA的水平明显增高(1.32±0.11)，8、12W时模型组比4W时模型组有所下降。4、12W时FYC低、中剂量组与模型组比较无统计学意义(p>0.05)；8W时低、中剂量组(0.96±0.03，0.94±0.04)与模型组(1.24±0.06)比较有显著差异(p<0.05)；4W时FYC高剂量组与模型组比较无统计学意义(p>0.05)；8、12W时FYC高剂量组MMP-13mRNA水平明显降低(0.70±0.01，0.51±0.02)，与模型组比较有显著差异(p<0.05)。 4W时正常组软骨TIMP-1mRNA的表达较多(2.86±0.65)，随时间延长变化不大。4W时模型组表达与正常组比较变化不大，8、12W时模型组表达明显减少，与正常组比较有统计学意义(p<0.05)。8、12W时FYC高剂量组TIMP-1mRNA的表达高于四环素组。12W时FYC中剂量组和8、12W时FYC高剂量组TIMP-1mRNA的表达比模型组增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。 4W时正常组软骨TIMP-2 mRNA表达较多(0.89±0.2)，随时间延长变化不大。4、8、12W时模型组表达明显降低，与正常组比较有显著差异(p<0.05)。8W时FYC高剂量组和12W时FYC中、高剂量组TIMP-2mRNA的表达比模型组增加，差异具有统计学意义(p<0.05)。试验结果还发现TIMP-1与TIMP-2的变化不一致。 4．FYC含药血清对软骨细胞增殖的影响 48h时结果显示，5％、10％、20％FYC含药血清对软骨细胞的增殖有促进作用，无递增效应。10％、20％FYC含药血清与5％空白血清组比较，有显著差异(p<0.05)；5％FYC含药血清组与5％空白血清组比较无明显差异(p>0.05)。72h时结果显示，5％、10％、20％FYC含药血清对软骨细胞增殖也有促进作用，但不及48h时的作用佳。同时也发现48h和72h时的10％FYC含药血清组作用强于20％FYC含药血清组。MTT法显示：10％FYC含药血清组在48h时，10ng/mlIL-1β对软骨细胞增殖的抑制作用最强。 5．FYC含药血清对软骨细胞p38信号通路的影响 FYC含药血清能够抑制p-p38蛋白在软骨细胞中的表达。10％FYC组与10％空白血清组比较差异显著(p<0.05)。在IL-1β的刺激下，10％空白血清+IL-1β组和10％FYC+IL-1β组比较有显著差异(p<0.05)。 FYC含药血清能够抑制MMP-13在软骨细胞中的表达。MMP-13在10％空白血清组和10％FYC组的表达较正常组明显增加，10％FYC组与10％空白血清组比较有明显差异(p<0.01)。FYC抑制IL-1β信号转导通路上的p-p38的表达，但抑制P38MAPK通路后，MMP-13的表达并未减少。 结论： 1．FYC对Hulth模型所致的骨关节炎软骨损伤有明显的保护作用。通过FYC不同剂量组、四环素组与模型组在关节软骨的外观、组织学评分、软骨组织超微结构的比较，表明FYC能降低软骨损伤的组织学评分，减缓胶原降解、抑制软骨退变。以8、12周时中、高剂量组的疗效最为明显。 2．FYC能抑制兔膝OA关节软骨MMP-13的活化，促进TIMP1、TIMP-2的生成，调节MMPs/TIMPs的平衡。 3．FYC能抑制兔膝OA关节软骨IL-1β的表达，促进TGF-β2的生成，调节细胞因子和生长因子的平衡。 4．FYC含药血清能促进体外培养的软骨细胞的增殖。 5．FYC含药血清对软骨细胞中IL-1β介导的P38MAPK信号通路上p-p38蛋白的表达有抑制作用，从而促进软骨修复。 6．FYC含药血清抑制软骨细胞中IL-1β介导的P38MAPK信号通路上MMP-13蛋白的表达，从而抑制了OA软骨基质的降解。

目录

论文说明：英文缩略语表

声明

摘要

前言

第一部分：复元胶囊对兔膝骨关节炎的组织形态学影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

6参考文献

第二部分：复元胶囊对兔膝骨关节炎MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、IL-1β、TGF-β2的作用研究

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5 小结

6参考文献

第三部分：复元胶囊含药血清对软骨细胞增殖的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

6参考文献

第四部分：复元胶囊含药血清对软骨细胞P38信号通路的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

5小结

6参考文献

全文结论

创新点及其意义

思考与展望

附图

文献综述一 基质金属蛋白酶及酶抑制物与骨关节炎的研究进展

文献综述二 骨关节炎的信号转导研究进展

文献综述三 骨关节炎的药物治疗研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文及申报的科研项目