Ezrin对UMR106细胞株生物学行为及移植瘤的生长和转移影响的实验研究

摘要

背景和目的: 骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤。肺转移是目前最常见的死亡原因，一旦发生预后明显变差，不可切除的肺转移死亡率几乎达100％。如何提高肺转移治愈率一直是临床研究的热点和难点。临床上约50％患者的肺转移是在治疗过程中出现的。如果能在治疗早期采用某种方法阻止肺转移的发生，将明显提高骨肉瘤的治愈率，是减少肺转移致死率的最佳方法。 肿瘤的远处转移是一个多步骤、多环节共同参与的复杂过程，众多活性因子参与其中。Ezrin被认为是肿瘤转移各环节、各通路的中心调控因子。已经发现Ezrin与多种恶性肿瘤的预后和转移相关。2001年，Khanna最先发现Ezrin在高转移骨肉瘤细胞株明显过度表达。后来，进一步研究证实抑制Ezrin表达能显著下调骨肉瘤细胞在肺内的存活能力。提示Ezrin可能成为基因治疗抑制骨肉瘤转移的一个靶点。 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是最近发展起来的一种高效的基因沉默技术，具有特异性强、效率高、操作简单、沉默程度可控、实验周期短、适用范围广、费用低等无可替代的优点。因而，一经发现就得到了迅猛发展，现已广泛用于基因功能、肿瘤、抗病毒治疗等方面的研究。目前关于Ezfin参与肿瘤转移方面的体内研究主要采用的是实验性肺转移模型，由于模型动物的限制不能如实反映临床骨肉瘤肺转移的过程，也不能研究Ezrin对原发灶的影响。因此本实验拟在以上研究的基础上，通过构建抑制Ezrin蛋白表达的shRNA干扰重组载体，下调UMR106大鼠骨肉瘤细胞株Ezfin蛋白的表达，体外研究干扰前后细胞增殖、运动、粘附和侵袭能力的改变；并以大鼠原位骨肉瘤荷瘤鼠做为肿瘤模型，体内观察Ezrin蛋白干扰对骨肉瘤肺转移及原位瘤生长的影响，为研究抑制骨肉瘤肺转移的基因治疗方法提供理论依据。 方法: (1)按照Elbashir等及Reynolds的设计原则设计并合成针对Ezrin蛋白编码基因villin2的shRNA，并克隆入转录载体pGenesil-1，构建重组质粒pshRNA1-viUin2，pshRNA2-viUin2和pshRNAHK-villin2(阴性对照质粒)；中量提取重组质粒，采用Lipofectamine<'TM> 2000转染UMR1069胃肉瘤细胞，应用RT-PCR和Western Blot法分别在mRNA和蛋白水平检测villin2基因的干扰效果。 (2)应用干扰效果较好的质粒大量转染UMR106细胞，体外应用MTT、细胞粘附实验和Transwell小室分别研究Ezrin蛋白干扰后细胞增殖、粘附、运动和侵袭能力的变化。 (3)采用LYMR106细胞原位移植法构建高肺转移率的大鼠骨肉瘤模型。分别用无血清培养基和鼠尾胶稀释扩增培养的UMR106细胞形成混悬液，原位移植至3周龄SD大鼠胫骨近端骨髓腔内，并给予免疫抑制剂和抗感染药物。观察肢体成瘤及肺内转移情况，X线检查骨质改变状况，HE染色组织学检查确定病变性质。 (4)应用G418筛选稳定转染重组质粒的UMR106细胞并进行大量扩增，按照(3)的方法建立SD大鼠原位移植骨肉瘤，以正常细胞及阴性对照质粒转染细胞的移植模型做对照，观察原位肿瘤出现时间、大鼠生存时间及肺转移的差异，并采用荧光显微镜和RT-PCR技术研究Ezrin蛋白被干扰细胞的体内分布。 结果: (1)成功构建三个重组质粒，分别为pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2和通用阴性对照质粒pshRNAHK-villin2；应用Lipofectamine<'TM>2000将上述重组质粒成功转染至UMR106骨肉瘤细胞内，转染效率高达90％。RT-PCR检测显示villin2基因在mRNA转录水平被显著抑制，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-Villin2分别抑制到正常细胞的23.12％和30.25％。Western Blot检测结果与RT-PCR相似，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-villin2分别将Ezrin蛋白抑制到正常细胞的12.32％和25.56％，pshRNA1-villin2干扰效果较好。 (2)以重组质粒pshRNA1-villin2转染UMR106细胞干扰Ezrin蛋白表达后细胞发生以下变化：①细胞增殖能力减弱，增殖抑制率达26.63％±20.65％；②细胞粘附力降低，仅为正常细胞的52.9％；③细胞运动及侵袭能力均降低，抑制率分别45.34±5.91％和50.69±5.96％。 (3)UMR106细胞混悬液原位移植SD大鼠胫骨近端骨髓腔成功构建了高肺转移的大鼠骨肉瘤模型，原位成瘤率及肺转移率均达100％。X线检查示明显骨质破坏和瘤骨形成，组织学检查见肿瘤样骨基质形成，符合临床骨肉瘤各项特征。培养基稀释组较鼠尾胶稀释组肿瘤形成时间早(10.0±1.65天 vs 17.8±0.87天，p<0.0001)，肺转移灶数目多(155.25±36.63个vs 91.5±29.56个，p<0.0001)，大鼠生存时间短(21.4±6,67天 vs40.6±9.52天，p<0.0001)。 (4)以重组质粒pshRNA1-villin2转染UMR106细胞，G418筛选并扩增培养2个月，UMR106的稳定转染细胞达细胞总数的50％以上，RT-PCR检测示mRNA为正常细胞的60.25％，Western Blot检测Ezrin蛋白降至正常细胞的50.56％。将筛选后细胞原位移植大鼠胫骨近端，结果证实：①Ezrin蛋白干扰后并未影响UMR106细胞原位肿瘤的形成，成瘤时间与正常细胞组和阴性对照组间无统计学差异(10.17±0.90天 vs 10.17±0.95天和10.08±0.88天，p>0.05)；②存活时间较正常细胞组和HK阴性对照组明显延长(42.8±17.28天 vs 21.3±6.72天和22.4±7.42天，p<0.0001)；③肺转移灶数目明显少于正常细胞组和HK阴性对照组(60.9±57.78个 vs 120.4±41.92个和117.6±36.48，p<0.0001)；④荧光显微镜和RT-PCR检测均证实Ezrin蛋白被干扰的稳定转染细胞只存在于原位瘤，而未转移到肺组织。 结论: (1)重组质粒pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2均能有效抑制UMR-106骨肉瘤细胞内Ezrin蛋白的表达，以pshRNA1一villin2干扰效果最好。 (2)Ezrin蛋白在细胞的增殖、粘附、运动和侵袭中起重要作用，Ezrin蛋白下调后可使细胞的上述能力减弱，转移能力降低。 (3)UMR106细胞混悬液原位移植SD大鼠胫骨近端构建的大鼠骨肉瘤模型肺转移率高，适合于骨肉瘤肺转移的研究。用无血清培养基重悬细胞成瘤早，肺转移灶多，大鼠存活时间短，适合肺转移机制方面的研究；鼠尾胶重悬细胞成瘤时间稍晚，肺转移数目略少，大鼠存活时间长，可用于肺转移治疗方面的研究。 (4)Ezrin蛋白不影响骨肉瘤原位肿瘤的生长，但是肺转移的必需因子，抑制：Ezrin蛋白的表达就能抑制骨肉瘤肺转移的发生。因此Ezrin蛋白可以作为预防骨肉瘤肺转移基因治疗的靶点。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

前言

第一部分：Ezrin蛋白短发夹状RNA表达载体的构建及鉴定

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

第二部分：Ezrin蛋白对UMR106细胞增殖、粘附、运动及侵袭能力的影响

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

第三部分：应用UMR106细胞株建立大鼠骨肉瘤肺转移模型

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

第四部分：Ezrin对UMR106骨肉瘤细胞株移植瘤生长及肺转移影响的实验研究

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

全文总结

参考文献

附图(一)

附图(二)

文献综述1：骨肉瘤动物模型的研究进展

文献综述2：RNAi技术的研究进展

致谢

攻读博士期间发表论文情况