HBx转染肝细胞株和肝癌细胞株的蛋白质组学研究

摘要

研究背景和目的： 蛋白质组学是后基因组时代蓬勃发展的技术体系，其特点是采用高通量、高分辨率的蛋白质鉴定技术，全景式的研究在特定条件下的蛋白质表达谱，并由此在蛋白质水平上获得对组织发育、疾病发生、细胞代谢等过程整体而全面的认识，高分辨率的蛋白质双向凝胶电泳和高灵敏度质谱技术相结合，是蛋白质水平研究的强有力武器。其中比较蛋白质组学最为常用。它不需要去描述整个细胞或组织的全部蛋白质组，却非常关注在生理状态和病理状态下蛋白质组的表达差异，适用于阐明单个基因功能及其信号转导机制研究。双向电泳分离－质谱分析－生物信息学鉴定是目前比较蛋白质组学研究的主要策略。1 乙肝病毒(HBV)感染是引起肝癌的主要原因之一。过去研究认为HBx基因是HBV复制和扩散的必需基因。在HBV相关的HCC中，HBx基因常被整合入宿主细胞基因组中（其整合率显著高于S,C基因），编码产生的HBX蛋白是一种多功能蛋白，是HBV导致肝癌的主要因素。HBX主要通过蛋白质-蛋白质相互作用，反式激活宿主细胞和病毒基因的启动子发挥作用，对病毒基因启动子的激活有助于感染的持续和播散。HBx对宿主细胞基因的影响包括：通过破坏P53功能等方法破坏细胞DNA修复功能；下调细胞周期检测点状态，促进细胞增殖；影响肝细胞凋亡；核内HBX可以通过反式激活一些基因的表达，促进HCC发生；胞质HBX可以通过激活一些信号传导通路导致肝癌的发生，如Ras、MAPK、PI3K-Akt、DAG-PKC、Src、JAK/STAT、Wnt/wingless等信号途径。虽然研究表明HBX引起的信号通路异常可能导致HCC发生，但肝癌的发生往往是多因素引起，但以往对HBX蛋白引起的单一信号通路异常的研究不能从整体、动态、网络的水平来研究HBV相关HCC发生机制。 本课题为了在细胞内找到确因HBX蛋白作用引起其他蛋白表达水平改变的证据，选择以正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2为研究模型，使用比较蛋白质组学的研究策略和技术方法，对比分析Ad-HBx腺病毒及空病毒转染后肝细胞L02与HepG2细胞蛋白质组的表达水平改变，找到相同的差异蛋白，进一步实验验证其功能，为阐明HBX功能及HBV相关HCC发生机制奠定基础，同时差异蛋白有可能作为HBV相关HCC药物作用靶标、诊断、预后指标。 研究策略和方法： 1．Ad-HBx及空病毒（对照）感染正常肝细胞L02，感染效率基本一致，检测HBX蛋白表达后提取细胞总蛋白；同样方法处理肝癌细胞HepG2。 2．双向电泳及图像分析：IPG(immobilized pH gradient)双向电泳分别分离上述两组细胞的总蛋白，PDQUEST8.0软件进行图像分析，筛选出差异表达蛋白斑点。 3．质谱和生物信息学鉴定蛋白质：候选差异表达蛋白斑点经胶内胰酶酶解， MALDI-TOF-MS分析，得到肽质指纹图谱（ peptide mass fingerprinting, PMF），使用Mascot在Swiss-prot数据库中检索鉴定蛋白质。 4．利用RT-PCR、Western Blotting分别在基因水平和蛋白质水平验证差异蛋白的改变。 实验结果： 1．Ad-HBx及空病毒感染正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2，感染率高, Ad-HBx感染细胞western blotting均检测到HBX蛋白表达，空病毒感染细胞未检测到HBX表达。 2．双向电泳及图像分析： IPG(immobilized pH gradient)双向电泳分别分离两组细胞总蛋白质，PDQUEST8.0软件进行图像分析，每个样品电泳图谱均在820±30个斑点左右,重复3次,有较好的重复性,随机筛选出差异表达特别明显蛋白斑点：正常肝细胞L02组9个，肝癌细胞HepG2组5个。 3．质谱和生物信息学鉴定蛋白质：候选差异表达蛋白斑点经胶内胰酶酶解， MALDI-TOF-MS分析，得到肽质指纹图谱（ peptide mass fingerprinting, PMF），使用Mascot在Swiss-prot数据库中检索鉴定蛋白质:鉴定出正常肝细胞L02组9个和肝癌细胞HepG2组5个蛋白。2个组中都表达上调的有2个蛋白：HSP70和GSTM3；下调的有1个蛋白：G3P。 4．利用RT-PCR验证了HSP70和GSTM3，结果显示在mRNA水平这两个基因均表达上调。Western Bloting验证差异蛋白HSP70,结果显示此蛋白在蛋白水平上表达上调。 结论： 1.本研究的实验结果表明，Ad-HBX及空病毒均能高效感染正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2,为研究HBx基因功能建立了细胞膜型。 2. Ad-HBx感染后蛋白质组发生了明显变化。这些变化涉及到细胞的能量代谢、应急反应等。LO2细胞及HepG2细胞中HBX蛋白均可能与HSP70蛋白、GSTM3蛋白存在相互作用。这些结果为阐明HBx基因功能及HBV相关HCC发生机制奠定基础，同时HSP70蛋白、GSTM3蛋白有可能作为HBV相关HCC药物作用靶标、诊断、预后指标。 意义： 首次同时既在正常肝细胞LO2也在肝癌细胞HepG2中研究了HBX蛋白引起蛋白质组的差异表达，两个组中相同差异蛋白较过去对HBX蛋白研究而言，证据更为充分，结论更为可靠。二个组中都表达上调的蛋白HSP70蛋白和GSTM3蛋白经进一步实验验证可能作为HBV相关HCC药物作用靶标、诊断、预后指标，为阐明HBx基因功能、HBV相关HCC发生机制奠定基础。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一章 Ad-HBx感染细胞模型的建立以及双向电泳分析

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

参考文献

第二章 蛋白质的质谱分析、数据库检索鉴定及结果分析与验证

1 材料和方法

2.实验结果

3.讨论

参考文献

全文总结

文献综述:蛋白质组学技术研究进展

致谢

硕士期间发表论文情况