新的甾体类药物NSC67657诱导HL60细胞分化时关键蛋白的筛选、鉴定及其功能研究

摘要

目的: 建立人急性早幼粒白血病细胞株HL60分别向粒系和单核系分化模型，运用比较蛋白质组学分析鉴定HL60细胞在甾醇类新药（NSC67657）和全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导下表达差异的蛋白质分子，并对其中筛选出来的差异蛋白β-catenin相关蛋白1（β-catenin-interacting protein1，ICAT）进行功能研究。 策略与方法: 1.验证NSC67657对CEBPα的促进作用并构建细胞分化模型：在基因和蛋白水平分析CEBPα在NSC67657作用下的表达变化情况，然后分别用NSC67657和ATRA作用HL60细胞，通过光镜、MTT试验、电镜、细胞表面分化抗原检测，细胞化学染色等方面，分析细胞分化方向，分化程度，以及诱导细胞分化最适药物浓度。通过流式细胞技术和电镜的联合使用，分析HL60细胞在诱导分化过程中凋亡的发生情况，保证后续蛋白筛查所得差异蛋白大部分和分化相关，而非和凋亡相关。 2.HL60细胞全蛋白双向电泳分离条件的优化：分别采用标准蛋白提取法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、超声破碎法等蛋白提取方法，在传统电泳和改良电泳条件下进行细胞全蛋白分离，并做蛋白点计数数和凝胶重复性分析，寻找新的针对HL60细胞省时高效的双向电泳条件。 3.运用比较蛋白质组在最适电泳分离条件下，分析HL60细胞在分化前，和向单核、粒系分化后的差异表达蛋白谱：依照前面优化双向电泳分离条件，对分化前和向单核系、粒系分化后HL60细胞总蛋白进行分离，用PDquest（7.0）软件对扫描的二维凝胶电泳图像进行分析，筛选出HL60细胞分化前后差异表达蛋白斑点。候选差异表达蛋白斑点经胶内胰酶酶解，MALDI-TOF-MS分析，得到肽指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF），使用Mascot软件在Swissprot数据库中检索鉴定差异表达蛋白质，并对差异蛋白质进行生物信息学分析。 4.验证仅出现在NSC67657处理组的差异蛋白点ICAT的表达差异情况，并对ICAT蛋白进行细胞内定位：使用NSC67657和ATRA分别作用HL60细胞，诱导其向两系分化，分别用RT-PCR、Western blot方法检测细胞分化前后ICAT在mRNA与蛋白水平的变化情况；然后双染ICAT蛋白和HL60细胞核，采用激光共聚焦的方法观察ICAT蛋白在细胞内的表达情况，并对其进行细胞内定位。 5.ICAT真核表达载体的构建、转染，并对转染细胞ICAT基因、蛋白的过表达进行验证：采用RT-PCR方法扩增加入了EcoRⅠ和BamHⅠ两个酶切位点的ICAT基因CDS全长序列，并克隆入带有红色荧光标签的真核表达载体pDsRed-C1，通过改良电转染技术，导入白血病HL60细胞和THP-1细胞，然后采用RT-PCR、Western blot方法对转染后细胞中ICAT基因和蛋白的高表达进行验证。 6.成功转染ICAT基因的HL60细胞生物学特征分析：采用MTT方法观察转染ICAT基因前后的HL60细胞在NSC67657作用下的增殖情况；应用流式细胞技术，细胞化学染色，电镜等方法检测转染前后及加有药物NSC67657作用前后细胞的分化情况。 7.ICAT基因在其他白血病细胞中的功能初探：采用流式细胞技术、和细胞化学染色方法观察NSC67657处理未转染和转染了pDsRed-ICAT真核表达载体的THP-1细胞分化情况。 结果: 1.药物作用HL60细胞后，CEBPα基因和蛋白的表达呈现先升高后下降的趋势；NSC67657和ATRA对急性早幼粒细胞株HL60的增殖有明显抑制作用，半数抑制浓度（50％ inhibitory concentration，IC50）分别是10μM和2μM。当用10μM NSC67657和2μM ATRA作用HL60细胞5天后，CD14和CD11b的表达分别达到90％以上，并出现明显肾形、畸形核的单核系分化细胞和呈杆状、分叶核的粒系分化细胞；胞浆可见较多嗜天青颗粒。未见细胞膜的磷脂酰丝氨酸外翻，细胞核染色质固缩及凋亡小体出现等凋亡现象； 2.在传统的高压聚焦的条件下，三种蛋白抽提方法所得蛋白分离条件不佳，可见大量横条纹和片状阴影；改良低压聚焦条件下，三种蛋白抽提方法所得蛋白分离均有所改善，三氯乙酸/丙酮沉淀法所得蛋白损失严重；超声破碎法所得蛋白点重复性差；标准蛋白抽提方法所得蛋白点数多，重复性好，结果可靠。蛋白分布于4～7居多，采用非线性pH3～10胶条最佳。 3.通过对分化前后的二维凝胶电泳图像进行对比分析，发现约有70个蛋白斑点表达有差异，对其中63个差异蛋白斑点进行MALDI-TOF-MS分析后，鉴定出了46种可能的差异表达蛋白。其中有24个差异蛋白点的变化趋势在两系分化中是相同的，有9个蛋白点仅在单核系分化后表达有差异，有13个蛋白点仅在粒系分化后表达有差异。 4.ICAT蛋白是仅在HL60细胞单核系分化前后表达差异的蛋白分子之一。通过验证，NSC67657处理后，ICAT在mRNA与蛋白水平都明显高于ATRA处理组和非处理对照组；激光共聚焦可见ICAT蛋白大多表达于细胞核和细胞浆中。 5.通过酶切、胶回收、测序，真核表达载体pDsRed-ICAT构建成功。随着改良电穿孔技术的支持，在成功转染了pDsRed-ICAT表达载体的HL60细胞中，验证了ICAT基因和蛋白的表达均明显增加。 6.pDsRed-ICAT真核载体转染HL60细胞前后，表面分化抗原CD14的表达无明显变化；NSC67657处理后，pDsRed-ICAT载体转染HL60细胞的增殖相对于对照组减慢更为明显，分化速度明显加快。 7.NSC67657可以诱导THP-1细胞向单核系分化，药物处理转染了pDsRed-ICAT真核载体的THP-1细胞相对于对照组，细胞增殖和分化无明显差异。 结论: 1.NSC67657可以促进HL60细胞CEBPα的表达，并且10μM的NSC67657和2μM的ATRA可以在不伴随凋亡发生的情况下，成功诱导HL60细胞向单核系和粒系分化。 2.低压聚焦为真核细胞蛋白质组分析提供了又一高效，省时，可靠的蛋白质分离方法。 3.鉴定出的50种差异表达蛋白可能在NSC67657和ATRA诱导细胞分化的途径中起到重要作用。 4.ICAT蛋白仅在NSC67657诱导HL60细胞向单核系分化过程中表达升高。 5.外源性ICAT基因在HL60细胞和THP-1细胞中成功表达。 6.ICAT基因的过表达可以促进NSC67657诱导HL60细胞的分化进程，但不影响THP-1细胞的分化，说明ICAT蛋白可能是粒单系祖细胞定向分化的新的药物作用靶点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分 NSC67657和ATRA诱导HL60细胞分化模型的建立

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第二部分 急性早幼粒白血病HL60细胞全蛋白双向电泳条件的优化

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第三部分HL60细胞向粒、单两系分化差异蛋白的筛选及其表达差异验证

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第四部分ICAT真核表达载体的构建及其在HL60细胞分化中的作用

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

第五部分ICAT蛋白高表达在THP-1细胞分化中的作用

1材料和方法

2结果

3讨论

小结

参考文献

全文总结及主要的研究结论

本课题的创新之处

本课题的不足之处与后续研究

文献综述一 干细胞蛋白质组学的研究进展

文献综述二 人红白血病K562细胞红系分化的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文