MafA基因真核表达质粒的构建及其在人肝癌细胞HePG-2中的表达和作用

摘要

实验目的: 胰岛素基因转录由胰岛素启动子引发，在这个过程中有许多转录调节因子参与，通过提高体内转录因子的产量，从而提高胰岛素基因的转录是一种可能有效的途径。肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A（Mus musculus v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family，protein A，MafA）是最近分离出来的转录因子，具有胰腺β细胞特异性，对于胰腺生长和β细胞（产生胰岛素的细胞）的分化及维持正常的β细胞功能至关重要。本实验拟构建可以表达小鼠MafA基因的真核表达质粒，转染入人肝癌细胞HePG-2，观察MafA基因在细胞中的表达，为进一步研究MafA功能及其作用机制奠定实验基础。 实验方法: 1.提取小鼠胰腺总RNA，经RT-PCR获得MafA基因片段，并在两端分别引入HindⅢ和SalⅠ酶切位点，重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2，pEGFP-C1中。 2.用脂质体转染至人肝癌细胞HePG-2细胞中，再通过三种不同葡萄糖浓度刺激已转染质粒的HepG2细胞，用荧光显微镜观察荧光表达，通过RT-PCR检测MafA基因和insulinⅡ基因的表达，通过WesternBlot检测融合蛋白EGFP-MafA的表达。 实验结果: 1.通过RT-PCR鉴定重组质粒时，在1080bp获取了明亮的条带。基因测序测得所获得得基因序列与GENEBANK报道MafA基因序列一致。 2.转入重组质粒的细胞有绿色荧光蛋白表达。Western Blot检测重组质粒表达时在70KD左右可见明显的条带。 3.通过RT-PCR检测insulinⅡ表达时，没有得到目的条带。 实验结论: 1.利用带有绿色荧光蛋白序列为报告基因的pEGFP-N2和pEGFP-C1，成功构建了可表达融合基因EGFP-MafA的真核表达质粒。pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA。 2.pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA重组质粒在肝癌细胞内可以成功表达融合蛋白MafA-EGFP，但是未诱导出胰岛素的表达，实验结果提示pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素。

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文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

第一部分：小鼠pEGFP-N2／MafA和pEGFP-C1／MafA重组质粒的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分重组质粒在肝癌细胞中的表达后功能的初步探讨

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述 MafA转录因子在胰岛β细胞的作用和调节

致谢

攻读学位期间发表的学术论文