凋亡抑制蛋白Livin在人乳腺癌中作用的研究

摘要

第一部分凋亡抑制蛋白Livin在人乳腺癌中的表达及意义。 目的：探讨在人乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞中Livin的表达情况，研究Livin在乳腺癌组织、良性肿瘤组织及癌旁乳腺组织的表达及意义，以及人乳腺癌组织中Livin的表达与临床病理特征的关系。 方法：采用免疫细胞化学、Western blot和Real-time-quantitive-RT-PCR等方法检测Livin在乳腺癌细胞株MCF-7、ZR-75-30、MDA-MB-231、MDA-MB-435s与乳腺上皮细胞株HBL-100中的表达情况。应用免疫组织化学方法测定Livin在人乳腺癌组织与乳腺良性肿瘤、癌旁乳腺组织的表达。 结果：①Livin在4株乳腺癌细胞株中的表达明显高于乳腺上皮细胞株（P<0.05）。②在4株乳腺癌细胞株中Livin的表达无明显差异（P>0.05）。③Livin在乳腺癌组织，良性肿瘤及癌旁乳腺组织的表达水平上结果有明显差异，乳腺癌组织的Livin表达明显高于良性肿瘤及癌旁乳腺组织（P<0.05）。④Livin在乳腺癌组织T≤2cm组中的表达明显低于T>2cm组（P<0.05）。⑤Livin在淋巴结转移阳性的乳腺癌中表达明显高于淋巴结转移阴性的乳腺癌（P<0.05）。⑥Livin在乳腺癌中组织学Ⅲ级组的表达高于Ⅰ和Ⅱ级组的表达（P<0.05）。⑦Livin在乳腺癌c-erBb-2（+）组的表达与c-erBb-2（-）组的表达无显著差别（P>0.05），在ER（-）组的表达与ER（+）组中的表达无显著差别（P>0.05）。 结论：在乳腺癌细胞株中Livin的表达显著增高；Livin在乳腺癌组织中表达明显增强。Livin的表达在T>2cm、有淋巴结转移、组织学Ⅲ级的乳腺癌组织中的表达增高，与c-erBb-2和ER的表达未见显著相关性。第二部分Livin蛋白siRNA真核表达载体的构建和鉴定。 目的：在人乳腺癌细胞中构建及鉴定Livin蛋白siRNA真核表达载体。探讨Livin siRNA对人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中Livin mRNA及蛋白表达的下调作用。 方法：构建三个靶向Livin的siRNA真核表达载体si-Livin1、si-Livin2、si-Livin3和si-HK（阴性对照质粒）；大量提取重组质粒，分别转染人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231后，通过Real-time-quantitative-RT-PCR和Western blot技术分别检测干扰前后乳腺癌细胞Livin蛋白和mRNA水平的表达。 结果：成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体。它们不同程度地抑制了乳腺癌细胞Livin基因的表达，以si-Livin2抑制效率最高。si-Livin2作用于人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231后能明显抑制其Livin基因的mRNA及蛋白表达水平（P<0.05）。 结论：靶向Livin的真核表达载体si-Livin1、si-Livin2、si-Livin3均能不同程度的抑制人乳腺癌细胞Livin mRNA和蛋白表达，以si-Livin2干扰效果最好。第三部分靶向Livin的siRNA真核表达载体对乳腺癌细胞株生物学功能的影响及可能机制。 目的：研究Livin蛋白siRNA真核表达载体作用于人乳腺癌细胞株后对其生物学功能的影响，探讨可能的作用机制。 方法：采用LipofectamineTM2000转染si-Livin2质粒到人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中，通过实时定量PCR、Western blot技术检测干扰前后乳腺癌细胞Caspase-3、7、9和Smac/DIABLO在mRNA、蛋白水平的表达；采用MTT法检测对细胞增殖的抑制作用，流式细胞法测细胞周期，TUNEL法检测细胞凋亡以及细胞对阿霉素化疗的增敏作用，观察细胞超微结构变化。 结果：Si-Livin2转染48 h后，与未转染组相比，MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖活力受到抑制；细胞周期重新分布，G0/G1期细胞比例明显增多（P<0.05），S期细胞比例明显减少（P<0.05）；细胞凋亡率显著升高（P<0.05），细胞对阿霉素的化疗敏感性增加；电镜下可见典型的凋亡细胞特征。细胞内Caspase-3、7、9和Smac/ DIABLO的mRNA、蛋白表达有不同程度的上升（P<0.05）。 结论：Livin siRNA通过上调Caspase-3、7、9和Smac/DIABLO表达，有效地抑制乳腺癌细胞增殖，诱导凋亡，对阿霉素的治疗可起到增敏辅助作用。第四部分Livin siRNA对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用。 目的：研究Livin siRNA真核表达载体对人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长抑制作用，探讨可能的作用机制。 方法：将人乳腺癌细胞株MDA-MB～231注射入裸鼠皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。分别向移植瘤中注射生理盐水，si-HK和si-Livin2质粒，检测观察肿瘤的生长情况，H.E染色观察肿瘤组织的病理改变，透射电镜观察肿瘤组织超微结构，TUNEL法检测细胞凋亡情况，免疫组织化学检测肿瘤Livin蛋白的表达变化，Western blot检测肿瘤Livin，Caspase-3和Caspase-9的表达变化。 结果：si-Livin2导入裸鼠皮下移植瘤后35天，其肿瘤体积明显低于空白组和对照组肿瘤，病理学检查及TUNEL检测发现，实验组肿瘤生长受到抑制，细胞凋亡指数显著高于空白组和对照组（P<0.05）；与空白组和对照组比较，实验组肿瘤Livin表达受到抑制，Caspase-3和Caspase-9蛋白的相对表达含量均有所升高。 结论：Livin siRNA能显著降低人乳腺癌裸鼠移植瘤Livin的表达，抑制MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长。

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文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

前言

第一部分 凋亡抑制蛋白Livin在人乳腺癌中的表达及意义

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第二部分 Livin蛋白siRNA真核表达载体的构建和鉴定

1材料

2方法

3结 果

4讨论

参考文献

第三部分 靶向Livin的siRNA对乳腺癌细胞株生物学功能的影响及可能机制

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第四部分 Livin siRNA对人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文总结

文献综述 凋亡仰制蛋白Livin与肿瘤的研究进展

致谢

攻读学位期间发表学术论文