人MKRN1基因shRNA真核表达质粒构建及其对HEK293细胞特性的影响

摘要

目的:构建人MKRN1基因shRNA真核表达质粒，并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达及细胞特性的影响，为进一步研究MKRN1基因的功能奠定基础。 方法:本课题设计并合成特异性针对MKRN1基因的小干扰片段，定向克隆到带有卡那霉素抗性和绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中，对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列测定。用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中，观察其对细胞MKRN1基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。选取最有效干扰序列，转染HEK293细胞，MTT法检测细胞其对细胞增殖的影响，FCM检测细胞周期分布。同时观察最有效干扰序列对细胞hTERT基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。 结果:通过酶切鉴定和序列测定，成功构建三条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒，转染HEK293细胞后，三条sbRNA真核表达质粒在mRNA水平对MKRN1抑制率分别为52.4％、26.2％、42.9％；在蛋白水平对MKRN1抑制率分别为69.1％、27.9％、50.0％。 与转染质粒pGenesil-1-MKRN1-shRNAhk和未转染组细胞比较，MTT检测显示，转染重组质粒pGenesil-1-MKRN1-shRNA1能明显促进HEK293细胞的增殖。FCM检测发现，转染重组质粒pGenesil-1-MKRN1-shRNA1组G2期和S期细胞增多，表明pGenesil-1-MKRN1-shRNA1可以促进HEK293增殖。RT-PCR、Western blot检测显示，在转染重组表达质粒pGenesil-1-MKRN1-shRNA1的HEK293细胞中，hTERT基因mRNA水平和蛋白水平表达明显升高。 结论:人MKRN1基因的shRNA真核表达质粒能特异性抑制HEK293细胞中人MKRN1基因的表达，伎hTERT基因表达上调，促进细胞增殖。

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前言

第一部分 shRNA真核表达质粒构建及其对HEK293细胞中人MKRN1基因表达的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二部分 shRNA真核表达质粒对HEK293细胞特性的影响

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

全文总结

参考文献

文献综述：hTERT与肿瘤基因治疗

致谢

硕士期间发的论文