CTP-β-gal融合蛋白在体内和体外的分布和动力学的研究

摘要

目的：胞浆转导肽（cytoplasmic transduction peptide，CTP），作为一种生物载体，能为一些由于胞浆蛋白缺陷而致的疾病提供新的治疗策略。我们前期的研究发现CTP融合BCR/ABL寡聚化区域（oligomerization domain，OD）在慢性粒细胞白血病K562细胞中对BCR/ABL癌蛋白有靶向的治疗作用。本课题拟通过评价CTP-β-gal融合蛋白在BaF3-P210细胞中的胞浆定位和酶活性能力，并测定融合蛋白在小鼠体内的动力学和组织分布，以此来探讨CTP-OD-HA融合蛋白在临床运用的可行性。 方法：将lacZ、CTP基因依次插入到质粒pET32a（+），通过转化、IPTG诱导融合蛋白CTP-β-gal表达，亲和层析纯化目的蛋白，最后Western blot鉴定纯化后的目的蛋白。融合蛋白CTP-β-gal转导BaF3-P210细胞，通过激光共聚焦显微镜、免疫组织化学分析和X-gal原位染色分析融合蛋白在细胞内的定位和活性能力。体内通过尾静脉注射雌性Balb/c小鼠，于注射后15min，1h，3h和24h收集肝脏、脾脏、肾脏、肺和脑组织。X-gal原位染色和定量酶活性分析检测CTP-β-gal融合蛋白在各种组织中的分布情况。 结果：成功构建原核表达质粒pET32a（+）-CTP-lacZ，纯化和Western blot鉴定了重组融合蛋白CTP-β-gal。激光共聚焦显微镜和免疫组织化学检测分析发现融合蛋白CTP-β-gal在BaF3-P210细胞中有很强的胞浆定位能力，且具有较高的酶活性能力。β-gal酶活性定量分析Balb/c小鼠各组织，发现CTP-β-gal融合蛋白酶活性在大多数组织中15min达高峰，仅脑组织是24h达高峰。 结论：本研究阐明了融合蛋白转导BaF3-P210细胞和静脉注射Balb/c小鼠后，CTP融合蛋白在细胞内的定位和酶活性能力以及在小鼠体内的动力学和组织分布情况，为CTP-OD-HA治疗CML提供了合理的理论基础，同时也为CTP融合蛋白胞浆转导发挥靶向治疗提供了实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英汉缩略语名词对照

声明

前言

实验技术路线

第一部分构建pET32a(+)-CTP-lacZ原核表达质粒和重组融合蛋白CTP-β-gal和β-gal的诱导表达,纯化和鉴定

1实验材料

2方法

3结 果

4讨论

第二部分探讨CTP-β-gal融合蛋白在BaF3-P210细胞的胞浆定位和酶活性及其在Balb/c小鼠体内的动力学和组织分布

1实验材料

2方法

3结 果

4讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述 ST1571对慢性粒细胞白血病的耐药机制研究

致谢

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