NE介导的PML-RARα融合蛋白裂解产物在APL发生中的分子机制研究

摘要

第一部分NLS-RARα与JTV1蛋白的细胞内共定位实验 目的：利用间接免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜观察NLS-RARα和JTV1蛋白在哺乳动物细胞内是否共定位表达。 方法：构建真核细胞表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTV1，经酶切鉴定后，共转染人胚肾293细胞，利用间接免疫荧光技术研究它们的表达是否存在细胞内共定位。 结果：构建的重组表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTV1经酶切鉴定成功，转染HEK293细胞。HA-NLS-RARα蛋白用抗HA的一抗和FITC结合的羊抗鼠IgG标记，Myc-JTV1蛋白用抗Myc的一抗和Cy3结合的羊抗兔IgG标记，激光共聚焦显微镜下可观察到两种蛋白的共定位表达。 结论：成功构建真核表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-JTV1，在HEK293细胞表达后利用间接免疫荧光技术证实NLS-RARα和JTV1蛋白在核内可共定位表达，从而进一步提示二者在细胞核内存在相互作用的可能。 第二部分早幼粒细胞白血病基因PML变异蛋白全长及其结构域诱饵载体的构建及鉴定 目的：为研究中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）酶切PML-RARα融合蛋白后产生的早幼粒细胞白血病基因（PML）的变异蛋白和其中含环指/B-BOX结构与含coiled-coil结构的两个结构域的功能，构建含其变异蛋白全长及结构域序列的诱饵表达载体，为进一步应用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白建立实验基础。 方法：PCR扩增mut-PML全长及其两个结构域序列，克隆入诱饵载体pGBKT7中，经测序鉴定后，将诱饵载体转化到酵母细胞AH109中，检测诱饵蛋白有无毒性，渗漏和自激活作用，同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。 结果：成功扩增mut-PML全长及其两个结构域的基因片段，并正确克隆入pGBKT7中。诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中，其中诱饵蛋白BD-mut-PML，BD-PML-B无毒性，但具有渗漏和自激活作用，诱饵蛋白BD-PML-C无毒性，渗漏和自激活作用，蛋白印迹法分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白。 结论：mut-PML全长和含环指/B-BOX的结构域具有转录因子活性；成功构建含coiled-coil结构的PML结构域的酵母诱饵表达载体。 第三部分酵母双杂交技术筛选在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白 目的：利用酵母双杂交技术筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质，为研究野生型PML和其变异体可能的作用靶点及其分子作用机制奠定基础。 方法：通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C，利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质。 结果：利用酵母双杂交技术初步筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆；经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆。 结论：在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用。NE介导的APL的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关。

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文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前言

第一部分NLS-RARα与JTV1蛋白的细胞内共定位实验

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.参考文献

第二部分 早幼粒细胞白血病基因PML变异体全长及其结构域诱饵载体的构建及鉴定

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.参考文献

第三部分 酵母双杂交系统筛选与PML-C相互作用的蛋白质

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.参考文献

全文总结

文献综述 白血病K562细胞株增殖分化相关转录因子研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文