乙型肝炎病毒包膜蛋白前S1区结合蛋白的分离鉴定

摘要

目的: 通过对HepG2细胞膜上乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）前S1区（preS1）结合蛋白的分离并进行质谱鉴定，以及对preS1与鉴定出的蛋白在细胞膜水平上和体外的相互作用进行研究，从而鉴定preS1在HepG2细胞膜上的结合蛋白，为继续深入探索乙型肝炎病毒的肝细胞膜受体进而揭示HBV的入侵机制打下基础。 策略与方法: 1.HepG2细胞膜上preS1结合蛋白的分离：利用基因重组技术将HBV preS1基因与GST标签在原核表达系统中融合表达；以融合蛋白GST-preS1为探针蛋白，与生物素标记膜蛋白的HepG2全细胞裂解液孵育，利用pull down技术分离HepG2细胞膜上与preS1结合的蛋白。 2.对分离出的preS1结合蛋白进行质谱鉴定：利用液相色谱/质谱联用离子阱质谱仪进行质谱分析，仪器根据质潜分析获得的肽序列谱图自动进行数据库搜索，采用Spectrum Mill proteomics software在SwissPort数据库中搜索针对人的序列，通过预设条件的筛选从而鉴定出相应蛋白。 3.对鉴定出的蛋白进行原核表达：从数据库中获得目的蛋白的基因序列，利用基因重组技术将基因与His标签在原核表达系统中融合表达。 4.用激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）观察鉴定出的蛋白在HepG2细胞中的分布情况，采用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术检测细胞膜水平上preS1与鉴定蛋白的相互作用。 5.通过体外结合试验进一步验证preS1与鉴定蛋白之间的相互作用。 结果: 1.成功构建了重组表达质粒pGST-preS1，并在原核表达系统中进行诱导表达。采用亲和层析法对表达的GST-prerS1融合蛋白进行纯化，纯度在90％以上，GST-preS1可以与抗preS1（37-45aa）位点的特异性单抗结合，显示出良好的抗原性。 2.以融合蛋白GST-preS1为探针蛋白，利用pull down技术，从HepG2细胞膜上分离到一分子量约为110kDa大小的蛋白条带（p110）。 3.切取p110蛋白条带进行质谱分析，通过相应筛选鉴定出了两个蛋白：78 kDa glucose-regulated protein precursor（GRP78）与LanC-like protein1（LANCL1）。 4.成功构建了重组表达质粒pW28-GRP78与pW28-LANCL1，并在原核表达系统中进行诱导表达，采用亲和层析法对表达的His-GRP78与His-LANCL1融合蛋白进行纯化，纯度在95％以上，融合蛋白可以与各自的特异性抗体结合，显示出良好的抗原性。 5.在激光扫描共聚焦显微镜下观察，可见GRP78均匀分布在HepG2细胞膜上，证实GRP78为膜蛋白成份。 6.preS1与培养的HepG2细胞孵育后，激光扫描共聚焦显微镜下可见GRP78与preS1在细胞膜上的共定位，应用FRET技术证实了二者在细胞膜上的结合。 7.通过体外结合试验，进一步证实了GRP78与preS1的相互作用。 结论: GRP78是HepG2细胞膜上与HBV包膜蛋白preS1区域结合的蛋白。通过本课题的研究，为继续深入探索乙型肝炎病毒的肝细胞膜受体进而揭示HBV的入侵机制打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前 言

参考文献

第一部分HepG2细胞膜上HBV包膜蛋白前S1区结合蛋白的分离

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

第二部分前S1区结合蛋白的质谱鉴定

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

第三部分 前S1区结合蛋白的原核表达与纯化

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

第四部分GRP78与preS1相互作用分析

第一节FRET验证细胞膜上preS1与GRP78的结合

1材料和方法

2 结果

3讨论

参考文献

第二节GRP78与preS1体外相互作用分析

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

全文总结

文献综述介导HBV入侵的相关蛋白研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表论文

攻读学位期间参加学术会议