儿童常见实体恶性肿瘤诊断和治疗相关基因筛选的研究

摘要

第一部分：动态监测小儿恶性肿瘤化疗儿外周血MDR1、MRP、LRP的表达
　　 目的：探讨小儿实体恶性肿瘤化疗患儿外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中多药耐药基因（Multi-drug resistancel，MDR1）、多药耐药相关蛋白基因（Multi-drugresistance-associated proteinl，MRP）、肺耐药蛋白基因（Lung resistanceprotein，LRP）的表达量及其与临床化疗的关系。
　　 方法：经病理证实的肿瘤患儿59例，其中神经母细胞瘤组24例，卵黄囊瘤组16例，淋巴瘤组19例；30例健康儿童作对照组。应用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）技术，检测化疗患儿化疗前后外周血和手术切除新鲜冻存组织，以及对照组外周血中MDR1、MRP、LRP的mRNA表达量；常规检测化疗患儿化疗前后相应肿瘤标志物的变化。运用统计学方法将化疗患儿化疗前与对照组外周血中MDR1、MRP、LRP的mRNA表达量进行T检验；化疗患儿化疗前后外周血中MDR1、MRP、LRP的mRNA表达量与手术切除肿瘤组织的MDR1、MRP、LRP的表达量、相应肿瘤标志物化疗前后的变化程度作相关性分析。
　　 结果：神经母细胞瘤组、卵黄囊瘤组化疗前MDR1的表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）；淋巴瘤组化疗前MDR1的表达量与对照组差异无统计学意义（P>0.05）；所有化疗患儿外周血中MRP、LRP表达量化疗前与对照组差异无统计学意义（P>0.05）。所有化疗患儿外周血MDR1表达量与同期手术切除的肿瘤组织MDR1表达量存在正相关（r=0.894，P=0.000）；化疗前外周血MDR1表达量与首次化疗后相应肿瘤标志物变化大小的关系，神经母细胞瘤尿香草杏仁酸（VMA）（r=-0.440，P=0.046），卵黄囊瘤甲胎蛋白（AFP）（r=-0.831，P=0.000），淋巴瘤乳酸脱氢酶（LDH）（r=-0.495，P=0.031）。化疗患儿随着化疗次数的增加MDR1表达量增加。
　　 结论：神经母细胞瘤与卵黄囊瘤可能存在一定程度的原发耐药；外周血的MDR1表达及组织MDR1表达与化疗疗效有明显负相关；化疗可诱导各种恶性实体瘤患儿：PBMCs中MDR1表达增加，对MRP、LRP影响不大；动态检测患儿化疗前后PBMCs中mdr1 mRNA水平对化疗疗效及预后判定有一定的参考作用。
　　 第二部分神经母细胞瘤相关标志物的检测
　　 目的：探讨运用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescencequantitative PCR，FQ-PCR）定量检测BCL-2基因mRNA在神经母细胞瘤（NB）的表达和运用ELISA方法检测神经母细胞瘤患儿外周血VEGF、NSE、SF的表达，及其与神经母细胞瘤发生、发展和预后的关系。
　　 方法：收集神经母细胞瘤患儿手术切除标本16例，--80℃保存，其中化疗前标本6例、化疗后标本8例、既有化疗前又有化疗后标本2例，并在设定时间采集患儿外周血，离心收集血浆-80℃保存。应用实时荧光定量PCR检测所有标本中BCL-2和N-MYC基因的mRNA表达情况，同时收集相应肿瘤标本的石蜡切片，进行免疫组化检测。运用ELISA方法检查神经母细胞瘤患儿外周中VEGF、NSE、SF的表达。采用Evans标准对神经母细胞瘤患儿进行临床分期，所有组织标本均进行Shimade分型。运用统计学方法比较Ⅰ～Ⅱ及ⅣS期与Ⅲ-Ⅳ期、F型与UF型、化疗前与化疗后神经母细胞瘤组织中BCL-2基因的mRNA表达量的大小及BCL-2蛋白表达阳性率的大小；分析BCL-2的表达与N-MYC基因和耐药基因表达的相关性；及化疗、手术前后外周血VEGF、NSE、SF的表达变化；BCL-2、VEGF、NSE、SF与神经母细胞瘤发生、发展、预后的关系。
　　 结果：实时荧光定量PCR检测的BCL-2基因mRNA在神经母细胞瘤组织中的表达量Ⅲ～Ⅳ期明显高于Ⅰ～Ⅱ及ⅣS期（P<0.05）、UF型明显高于F型（P<0.05）、化疗后高于化疗前的表达（P<0.05），免疫组化结果与PCR结果基本一致；BCL-2的表达与N-MYC的拷贝数呈明显正相关（P<0.05），与耐药基因的表达无明显相关（P>0.05）；BCL-2、VEGF、NSE、SF的表达量与神经母细胞瘤患儿的预后呈负相关（P<0.05）。
　　 结论：BCL-2作为一种重要的凋亡调控基因，运用实时荧光定量PCR检测其在神经母细胞瘤中的表达量，可作为判断神经母细胞瘤生物学特性和预后的重要指标。VEGF、NSE、SF作为外周血中的肿瘤标志物，可作为化疗疗效监测及预后判断的重要指标。